流式细胞凋亡分析精选课件.ppt

关于流式细胞凋亡分析第一页，本课件共有106页概概 念念 细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosisapoptosis）是指有核细胞）是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，在一定条件下通过启动其内部自身机制，主要是通过内源性主要是通过内源性DNADNA内切酶的激活而发生内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。一种普遍存在的现象。第二页，本课件共有106页概概 念念 细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活动过能活动所必需的，是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。需要，贯穿了生物全部生命周期中。第三页，本课件共有106页概概 念念 细胞凋亡与细胞坏死（细胞凋亡与细胞坏死（necrosisnecrosis）是细胞）是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反应。致周围组织的炎症反应。第四页，本课件共有106页概概 念念细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：清除无功能的细胞；清除无功能的细胞；控制细胞数量；控制细胞数量；清除病态的或有害的细胞；清除病态的或有害的细胞；清除多余的细胞；清除多余的细胞；第五页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链集可能是由于凋亡细胞核双链DNADNA发生裂解所致。发生裂解所致。第六页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：DNADNA降解后，形成长度主要为降解后，形成长度主要为180-200bp180-200bp的的DNADNA片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体（体，称为凋亡小体（apoptotic bodies),apoptotic bodies),最后最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞在显微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。发生了凋亡。第七页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核核DNADNA在核小体连接处断裂成核小体后，在异在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。细胞骨架变得致密、紊乱。第八页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：第九页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：第十页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,ps)phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除有白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。关。第十一页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：凋亡细胞另一个形态特征通过总凋亡细胞另一个形态特征通过总DNADNA提取，提取，DNADNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见清晰的清晰的DNADNA梯子梯子(ladder)(ladder)。第十二页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如DNADNA、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致使细胞发生凋亡。使细胞发生凋亡。第十三页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为结构和功能特性而被称为caspasecaspase。第十四页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：caspasecaspase可能在凋亡细胞的形态变化中起了可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。主导作用。CaspaseCaspase通常是以酶原形式存在，通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的酶，活化的caspasecaspase进一步激活其他的进一步激活其他的caspasecaspase前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。的大分子物质，导致凋亡。第十五页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：目前已发现目前已发现1515个个caspasecaspase家族成员，分别家族成员，分别命名为命名为caspase-1caspase-11515，并根据其功能特点分成，并根据其功能特点分成两类，即启动两类，即启动caspase(caspase-2caspase(caspase-2、8 8、9 9、1010）和效应和效应caspase(caspase3caspase(caspase3、6 6、7 7）。）。第十六页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：启动启动caspasecaspase作用于凋亡信号触发后上游作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。效应的不可逆位点。效应caspasecaspase由启动胱冬肽酶激由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体，体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。通过线粒体方式执行凋亡的信号。bcl-2bcl-2家族成家族成员能调节执行位点的进程。员能调节执行位点的进程。第十七页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：caspase-3caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为是最重要的指示蛋白酶，为17kD17kD和和12kD12kD亚单位组成的异二聚体。活化的亚单位组成的异二聚体。活化的caspase-3caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他可以蛋白水解切割和激活其他caspasecaspase、相关的胞质靶位点（细胞因子、相关的胞质靶位点（细胞因子1818，CK18)CK18)和细胞核靶位点。和细胞核靶位点。Caspase-3Caspase-3切割切割CK18CK18是是凋亡过程中凋亡过程中caspasecaspase切割发生的早期指示因子。切割发生的早期指示因子。第十八页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：2 2 核酸内切酶的激活：核酸内切酶的激活：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接将核小体间连接DNADNA降解，形成长度主要为降解，形成长度主要为180-200bp180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在DNADNA凝胶电泳分析中呈现出特征性凝胶电泳分析中呈现出特征性“梯状梯状”条带，而细胞坏死时，条带，而细胞坏死时，DNADNA片断大小不一，无片断大小不一，无“梯状梯状”条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。测到这种典型的生化特征。第十九页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：2 2 核酸内切酶的激活：核酸内切酶的激活：第二十页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化：线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通道开放，使子使线粒体通透性升高，膜上巨型通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。与呼吸链解偶联。第二十一页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化：线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的实施。与凋亡密切相关的bcl-2bcl-2家族分布在细家族分布在细胞内膜系统，其中线粒体外膜上分布最多，胞内膜系统，其中线粒体外膜上分布最多，bcl-2bcl-2具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。过此途径抑制细胞凋亡。第二十二页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：细胞内细胞内CaCa2+2+和和H H+浓度的稳定对维持生命活浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内动至关重要。胞内CaCa2+2+库的释放，胞质库的释放，胞质CaCa2+2+与与细胞凋亡关系密切。胞外细胞凋亡关系密切。胞外CaCa2+2+内流促使胞质内流促使胞质CaCa2+2+持续升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。持续升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。第二十三页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：此外，此外，CaCa2+2+的释放打破了细胞内结构的稳的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。触发细胞凋亡。第二十四页，本课件共有106页细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：细胞细胞pHpH的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时伴随胞质伴随胞质pHpH降低，胞质酸化影响细胞凋亡。降低，胞质酸化影响细胞凋亡。胞质胞质pHpH降低可能与胞质降低可能与胞质CaCa2+2+升高有关。胞质酸升高有关。胞质酸化主要通过激活酸性化主要通过激活酸性DNaseDNase启动细胞凋亡。启动细胞凋亡。pHpH降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。过程中的作用。第二十五页，本课件共有106页细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 细胞凋亡受基因的调控，其机制非常复细胞凋亡受基因的调控，其机制非常复杂。凋亡基因可分为两类：杂。凋亡基因可分为两类：1 1诱导基因：野生型诱导基因：野生型p53p53基因、基因、c-mycc-myc、细胞表面、细胞表面抗原基因抗原基因Apo-1(Fas)Apo-1(Fas)等等2 2抑制基因：抑制基因：bcl-2bcl-2、突变型、突变型p53p53基因和基因和rasras基基因等因等 第二十六页，本课件共有106页细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调，可提高调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调，可提高细胞对凋亡信号的敏感性，促进凋亡发生。抑制细胞对凋亡信号的敏感性，促进凋亡发生。抑制基因蛋白产物表达，可降低细胞对凋亡信号的敏基因蛋白产物表达，可降低细胞对凋亡信号的敏感性，抑制或推迟凋亡。感性，抑制或推迟凋亡。第二十七页，本课件共有106页细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控，衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时，维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、就会导致疾病，如肿瘤、AIDSAIDS、霍奇金淋巴、霍奇金淋巴瘤等。瘤等。第二十八页，本课件共有106页细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：1 bcl-2 1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。是研究最早的与凋亡有关的基因。bcl-2bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径，而对的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子，如细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、化疗药物、某些病毒、p53p53、c-mycc-myc及生长因子及生长因子等激发的凋亡。等激发的凋亡。第二十九页，本课件共有106页细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：2 p53 p532 p53 p53基因不仅是一种与肿瘤发生、发基因不仅是一种与肿瘤发生、发展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、分展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、分化及死亡的调控。化及死亡的调控。P53P53在调节凋亡中起重要在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或gammagamma射线照射后，含正常射线照射后，含正常p53p53的细胞，可发的细胞，可发生凋亡，而生凋亡，而p53p53基因缺失或突变的细胞则表现出基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。野生型对电离射线和化疗药物的抗性。野生型p53p53对凋对凋亡起促进作用，突变型亡起促进作用，突变型p53p53对凋亡起抑制作用。对凋亡起抑制作用。第三十页，本课件共有106页细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：3 Fas3 Fas和和FasFas配体配体 FasFas是肿瘤坏死因子（是肿瘤坏死因子（TNFTNF）受）受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。FasFas配体（配体（Fas ligand,FasL)Fas ligand,FasL)是是TNFTNF家族的细家族的细胞表面分子。胞表面分子。FasLFasL与其受体与其受体FasFas结合导致携带结合导致携带FasFas的细胞凋亡。抗的细胞凋亡。抗FasFas抗体、表达抗体、表达FasLFasL的细的细胞和可溶性的胞和可溶性的FasLFasL与与FasFas交联均产生细胞凋亡交联均产生细胞凋亡信息，而信息，而bcl-2bcl-2过度表达能抑制过度表达能抑制FasFas致凋亡作用。致凋亡作用。第三十一页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人们认识到在肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也们认识到在肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡有可能决定发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡有可能决定着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减少，在肿瘤着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减少，在肿瘤发生、发展中起着重要作用。发生、发展中起着重要作用。第三十二页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：凋亡调节基因的紊乱、凋亡机制蛋白的凋亡调节基因的紊乱、凋亡机制蛋白的增加是肿瘤形成的重要机制。用于调控肿瘤增加是肿瘤形成的重要机制。用于调控肿瘤细胞凋亡的基因主要有细胞凋亡的基因主要有bcl-2bcl-2基因家族、基因家族、p53p53基因、基因、FasFas基因家族和基因家族和c-mycc-myc基因家族。基因家族。第三十三页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见凋许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见凋亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化生等亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化生等病变中起决定性作用，但胃癌的凋亡指数低病变中起决定性作用，但胃癌的凋亡指数低于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘膜病变细于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘膜病变细胞凋亡减少、生存期延长、细胞大量堆积可胞凋亡减少、生存期延长、细胞大量堆积可能是胃癌发生、浸润及转移的基础。能是胃癌发生、浸润及转移的基础。第三十四页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指数与肿瘤内部微血管密度成负相关，并与胃指数与肿瘤内部微血管密度成负相关，并与胃癌的组织类型有关。癌的组织类型有关。第三十五页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：许多以免疫功能异常为主要特征的疾病均许多以免疫功能异常为主要特征的疾病均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形态的发存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的发生中生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的发生中起重要作用。起重要作用。第三十六页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及以及CD40/CD40LCD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活们通过激活T T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B B淋淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。第三十七页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及以及CD40/CD40LCD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活通过激活T T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B B淋淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。第三十八页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：近来研究发现，淋巴细胞凋亡作用的缺陷与近来研究发现，淋巴细胞凋亡作用的缺陷与系统性红斑狼疮（系统性红斑狼疮（SLESLE）的发生、发展有密切关）的发生、发展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是自身基因调控异常系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是自身基因调控异常的结果。目前已明确定义为自身基因的有的结果。目前已明确定义为自身基因的有FasFas和和bcl-2bcl-2等。等。第三十九页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与皮肤病：细胞凋亡与皮肤病：某些皮肤病是以凋亡的增加为特征。银某些皮肤病是以凋亡的增加为特征。银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡的形态屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡的形态学和生化特征。学和生化特征。plaqueplaque基底细胞层基底细胞层bcl-2bcl-2阳性阳性细胞数显著下降。细胞数显著下降。第四十页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与皮肤病：细胞凋亡与皮肤病：自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病等，自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫异常与自身反应性其免疫异常与自身反应性T T、B B淋巴细胞凋亡缺淋巴细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、发展与细胞凋陷有关。恶性黑色素瘤的发生、发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。此外，亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自动消退有关。细胞凋亡与皮肤肿瘤自动消退有关。第四十一页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病：以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明，由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明，全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。大全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经细胞脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经细胞很快坏死，但周围的神经细胞，以海马很快坏死，但周围的神经细胞，以海马CAICAI区区的锥形细胞最为明显，要经过一个潜伏期才的锥形细胞最为明显，要经过一个潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，即细胞凋亡。出现延迟性神经细胞退化，即细胞凋亡。第四十二页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病：这种凋亡发生在缺血后这种凋亡发生在缺血后1-21-2天，并在缺天，并在缺血周边区域出现血周边区域出现bcl-2bcl-2蛋白的表达。而且，蛋白的表达。而且，不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细胞、不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管壁中也有表达，这提示非致内皮细胞和血管壁中也有表达，这提示非致死性的损伤导致细胞产生死性的损伤导致细胞产生bcl-2bcl-2，以抵抗细，以抵抗细胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组织中检测胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组织中检测到到FasFas抗原抗原mRNAmRNA明显增加，提示明显增加，提示FasFas在凋亡中在凋亡中起一定作用。起一定作用。第四十三页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病：除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡，灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌梗死的大小取决于细胞尤其在梗死早期。心肌梗死的大小取决于细胞凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性心脏病演凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性心脏病演化为心力衰竭的细胞学机制。化为心力衰竭的细胞学机制。第四十四页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病感染性疾病：感染性疾病：HIVHIV感染可导致感染可导致AIDSAIDS。其感染的细胞学。其感染的细胞学特征是特异性破坏特征是特异性破坏CD4+TCD4+T淋巴细胞，造成相关淋巴细胞，造成相关免疫功能缺陷，导致感染和肿瘤。在免疫功能缺陷，导致感染和肿瘤。在HIVHIV感染感染过程中，从过程中，从HIVHIV对对CD4+TCD4+T淋巴细胞黏附、病毒淋巴细胞黏附、病毒颗粒进入细胞、颗粒进入细胞、HIVHIV基因组在细胞中复制和装基因组在细胞中复制和装配以及出芽释放等环节，都与细胞凋亡密切配以及出芽释放等环节，都与细胞凋亡密切相关。相关。第四十五页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病其他疾病：其他疾病：肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均发肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均发现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小球硬现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小球硬化和肾功能衰竭有关。血管动脉粥样硬化形化和肾功能衰竭有关。血管动脉粥样硬化形成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋亡同时存成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋亡同时存在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制、粥样病灶在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制、粥样病灶的形成和斑块的剥脱有一定的影响。的形成和斑块的剥脱有一定的影响。第四十六页，本课件共有106页细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病 通过对各种疾病细胞凋亡的研究，使我通过对各种疾病细胞凋亡的研究，使我们对疾病的发生机制有了新的认识，同时也们对疾病的发生机制有了新的认识，同时也为疾病的治疗提供了新的思路。为疾病的治疗提供了新的思路。第四十七页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。显微镜下观察。第四十八页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。如通过苏木素显微镜下观察。如通过苏木素-伊红（伊红（HE)HE)染色、染色、吉姆萨（吉姆萨（Giemsa)Giemsa)染色、甲基绿染色、甲基绿-哌诺宁染色在哌诺宁染色在普通光学显微镜下观察；通过荧光染料如丫啶普通光学显微镜下观察；通过荧光染料如丫啶橙（橙（AO)AO)、Heochst33258Heochst33258染色在荧光显微镜染色在荧光显微镜下观察；或制成超薄切片用电子显微镜观察，下观察；或制成超薄切片用电子显微镜观察，以区别凋亡和坏死。以区别凋亡和坏死。第四十九页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 FCMFCM可间接观察凋亡细胞形态学变化，主要可间接观察凋亡细胞形态学变化，主要是根据未经染色的凋亡细胞的光散射特征进行检是根据未经染色的凋亡细胞的光散射特征进行检测。测。第五十页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 FCMFCM提供的散射光参数主要包括前向散射提供的散射光参数主要包括前向散射光（光（FSCFSC）和测向散射光（）和测向散射光（SSCSSC）。）。FSCFSC主要与主要与细胞大小有关，对同一个细胞群体，散射光细胞大小有关，对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些，散射光弱的，其细胞强的，其细胞大一些，散射光弱的，其细胞小一些。小一些。SSCSSC主要与细胞内部颗粒密度有关，主要与细胞内部颗粒密度有关，颗粒密度越大，颗粒密度越大，SSCSSC就越大，而颗粒密度越就越大，而颗粒密度越小，小，SSCSSC就越小。就越小。第五十一页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、细胞皱缩，因此这一阶段凋亡细胞细胞皱缩，因此这一阶段凋亡细胞FSCFSC较活较活细胞小，而细胞小，而SSCSSC较之增强或无明显变化。较之增强或无明显变化。第五十二页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩更当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩更加明显，核质的变化导致细胞内颗粒密度明加明显，核质的变化导致细胞内颗粒密度明显增强，显增强，FSCFSC进一步变小，而进一步变小，而SSCSSC却明显增大。却明显增大。最终，当凋亡小体形成时，最终，当凋亡小体形成时，FSCFSC明显缩小。明显缩小。第五十三页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 此外，也可通过此外，也可通过FSCFSC区分坏死细胞和凋亡细区分坏死细胞和凋亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其FSCFSC增大，增大，SSCSSC在细胞坏死时也增大。但晚期凋亡细胞的在细胞坏死时也增大。但晚期凋亡细胞的FSCFSC和和SSCSSC与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的细与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的细胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时，其胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时，其FSCFSC和和SSCSSC均明显变小。均明显变小。第五十四页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡第五十五页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 但实际上，由于被检测细胞形态上的但实际上，由于被检测细胞形态上的均一性和核均一性和核/质比例不同，凋亡不同阶段的细质比例不同，凋亡不同阶段的细胞，其光散射参数的变化不同，有时很难准确胞，其光散射参数的变化不同，有时很难准确检测到凋亡细胞。但将光散射参数与荧光标记检测到凋亡细胞。但将光散射参数与荧光标记的抗体或荧光染料结合起来检测细胞凋亡，可的抗体或荧光染料结合起来检测细胞凋亡，可以克服单纯的光散射参数的缺点。以克服单纯的光散射参数的缺点。第五十六页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 凋亡细胞的一个重要特点是很长一段凋亡细胞的一个重要特点是很长一段时间里细胞膜结构未受影响，其主要表现时间里细胞膜结构未受影响，其主要表现为：维持膜的基本功能，如离子和大分子为：维持膜的基本功能，如离子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。的屏蔽作用和具有功能的通道泵。第五十七页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收或排斥作用不同，可用流式细胞仪定量检测活或排斥作用不同，可用流式细胞仪定量检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比。细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比。第五十八页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 处于早处于早/中期的凋亡细胞，仍然保持着中期的凋亡细胞，仍然保持着完整的质膜及其基本功能，阻碍大分子物完整的质膜及其基本功能，阻碍大分子物质及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞或质及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞或坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某些大分子物质及离子可以进入细胞内。因些大分子物质及离子可以进入细胞内。因此，根据对此，根据对DNADNA染料通透性的不同，可区分染料通透性的不同，可区分处于不同阶段的细胞。处于不同阶段的细胞。第五十九页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 PIPI和和EBEB均属于插入性荧光染料，可选择性均属于插入性荧光染料，可选择性的定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发的定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发射均为橙红色，如果使用氩离子激光射均为橙红色，如果使用氩离子激光488nm488nm激发，激发，PIPI的发射光谱波长在的发射光谱波长在610-620nm610-620nm范围，范围，EBEB的的发射光谱波长在发射光谱波长在603-610nm603-610nm之间，二者可互相之间，二者可互相替代，但替代，但EBEB毒性较大。毒性较大。第六十页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 7-7-氨基氨基-放线菌素放线菌素D D（7-AAD7-AAD）主要以插入）主要以插入方式与方式与DNADNA链的链的G-CG-C碱基对结合，其激发波长碱基对结合，其激发波长约为约为580nm580nm，最大发射波长为，最大发射波长为660nm660nm，由于其，由于其发射波长较大，可与藻红蛋白（发射波长较大，可与藻红蛋白（PEPE）结合，）结合，通过单一光谱通过单一光谱488nm488nm的激光光源激发，可以的激光光源激发，可以进行定量进行定量DNADNA和免疫荧光的双参数分析。和免疫荧光的双参数分析。第六十一页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 由于由于EBEB、PIPI和和7-AAD7-AAD不能进入具有完整细不能进入具有完整细胞膜的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在未胞膜的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在未固定时对这些染料是拒染的，而坏死细胞胞膜固定时对这些染料是拒染的，而坏死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。因此，这些染料可完整性已破坏，可被染色。因此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细胞。被用来鉴别死细胞和活细胞。第六十二页，本课件共有106页流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 赫斯特类染料（特别是赫斯特类染料（特别是HO33342)HO33342)检测细胞检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。凋亡的原理与上述染料不同。HO33342HO33342是双苯并是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与咪唑家族成员之一