实验一谷胱甘肽.ppt

生物技术综合实验生物技术综合实验实验一、不同方法从干酵母中实验一、不同方法从干酵母中提取谷胱甘肽的比较提取谷胱甘肽的比较实验目的实验目的n掌握从干酵母中粗提谷胱甘肽的各种方法；n掌握还原型谷胱甘肽定量的方法。实验材料实验材料n试剂：试剂：活性干酵母粉，36乙酸溶液，2H2SO4 溶液，乙酸：乙醇（v/v=2:1)溶液 5碘化钾溶液，0.0001mol/L碘酸钾溶液，2%偏磷酸溶液，淀粉指示剂n仪器：仪器：低速离心机实验原理实验原理n谷胱甘肽的性质n从活性干酵母中提取谷胱甘肽的原理及评价方法优劣的指标n提取的注意事项n工业上提取谷胱甘肽的流程谷胱甘肽的性质谷胱甘肽的性质n性质性质1.谷胱甘肽是由谷氨酸谷氨酸、半胱氨酸半胱氨酸和甘氨酸甘氨酸组成的三肽，半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼的巯基决定了其有氧氧化型（化型（GSSG）和还原型（和还原型（GSH）两种形式两种形式。2.谷胱甘肽的分子量为307.2，等电点为5.93，溶于水、稀醇、有机酸、酯类，不溶于醇、醚、丙酮；在水溶液中易被氧化，在在pH3.07.0环境下较稳定环境下较稳定。3.谷胱甘肽广泛存在于动、植物和微生物体内，干酵母中干酵母中含有约含有约1谷胱甘肽谷胱甘肽，是提取谷胱甘肽最常用的原料。n生理功能生理功能 抗氧化、清除自由基、解毒（CO、重金属）等。原理原理n提取原理提取原理 谷胱甘肽是小分子物质谷胱甘肽是小分子物质，且在水中的溶解度较大，故可选择一些温和的方法从干酵母中提取谷胱甘肽。在细胞不完全破碎的条件细胞不完全破碎的条件下，只要细胞壁表面出现一些裂缝，谷胱甘肽就可以扩散到溶剂中扩散到溶剂中。n评价指标评价指标1.还原态谷胱甘肽的提取率提取率；2.杂质（蛋白质、核酸等）释放量少杂质（蛋白质、核酸等）释放量少，便于后续进一步分离纯化；3.简便易行、提取效率高、成本低简便易行、提取效率高、成本低。注意事项注意事项n提取温度要尽量低提取温度要尽量低，但反复冻融谷胱甘肽易分解；n提取时间要尽量短提取时间要尽量短，防止其被氧化；n谷胱甘肽在偏酸性的条件下易保持还原态在偏酸性的条件下易保持还原态；n适当的固液比适当的固液比，既保证尽量多的谷胱甘肽被溶出也保证提取液中谷胱甘肽的浓度较高，便于后续的分离纯化。n适当的搅拌速度适当的搅拌速度，既保证适当的传质速度，便于谷胱甘肽扩散到溶剂中，也保证工业生产中能耗适当。工业上提取谷胱甘肽的流程工业上提取谷胱甘肽的流程酵母高产酵母诱变剂：亚硝基胍、紫外线热水抽提热水抽提离心去残渣提取液调pH7.0左右吸附层析法吸附层析法：壳聚糖做吸附剂pH4.5左右的磷酸盐缓冲液洗脱浓缩脱色喷雾干燥成品实验步骤实验步骤1.热水提取法热水提取法：1g 干酵母，加15mL 热水，95度水浴10min，立即冷却，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积。2.冷冻研磨处理后有机酸搅拌提取冷冻研磨处理后有机酸搅拌提取：1g 干酵母，先在研钵中研细，加入10mL蒸馏水混匀，20度冷冻呈半固体状，研磨5min，加入5mL36乙酸，室温下搅拌提取15min，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积。3.酸热处理酸水搅拌提取酸热处理酸水搅拌提取：1g 干酵母，加入15mL 2 H2SO4，60度水浴下搅拌抽提15min，立即冷却，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积。4.有机酸稀醇搅拌提取有机酸稀醇搅拌提取：1g 干酵母，加入15mL 乙酸乙醇混合液（v:v=2:1），室温下搅拌抽提15min，取8mL离心（5000rpm，15min），取5mL上清液滴定，记录滴定体积。注：注：待滴定的谷胱甘肽提取液置待滴定的谷胱甘肽提取液置4度冰箱保存，防止其被氧化。度冰箱保存，防止其被氧化。n氧化还原滴定法确定谷胱甘肽的含量氧化还原滴定法确定谷胱甘肽的含量 KIO35KI6HPO3 3I26KPO33H2O 碘酸根离子在酸性条件下具有氧化性碘酸根离子在酸性条件下具有氧化性，能与还原态的谷胱甘肽（GSH）反应，当GSH全部反应完时，碘酸根离子将碘化钾氧化为碘，碘使淀粉指示剂变蓝色色，即为滴定终点。n操作操作 吸取5mL上清液，5mL 2%偏磷酸溶液，1mL 5%碘化 钾溶液于250mL锥形瓶中，并滴入2滴淀粉指示剂，用 0.0001mol/L碘酸钾标准溶液滴定至终点。注意事项：注意事项：1.在酸性溶液中，淀粉会缓慢水解，使滴定终点的 颜色发生变化，故滴定操作要快速完成。实验结果实验结果处理方法热水提取 冷冻研磨处理后有机酸搅拌提取酸热处理酸水搅拌提取有机酸稀醇搅拌提取滴定体积（mL）思考题思考题n比较本实验四种方法的优缺点。