ELISA原理、方法及操作细节.ppt

ELISAELISA酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验主讲人：刘主讲人：刘 畅畅 研究生研究生导导 师：马学恩师：马学恩 教教 授授ELISAELISA（酶联免疫吸附试验）（酶联免疫吸附试验）Enzymes linked immunosorbent assay简简 介介19711971年，瑞典学者年，瑞典学者EngvailEngvail和和PerlmannPerlmann、荷兰学者、荷兰学者Van SchuursVan Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。试验。ELISA ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。应相结合而建立的一种新技术。该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗抗体系统均可用以检测。体系统均可用以检测。酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。而证明发生了相应的免疫反应。所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。基基 本本 原原 理理l先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性并保持其免疫活性。l测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。l用洗涤的方法分离抗原用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。抗体复合物和游离成分。l 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量。量。方方 法法 类类 型型酶联免疫吸附试验的主要技术类酶联免疫吸附试验的主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、竞型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。争法、捕获法等。1 1，双抗体夹心法：，双抗体夹心法：此法常用于检测抗原此法常用于检测抗原它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和和B分别与固相载体上的抗体分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体和酶标记抗体B结结合，形成合，形成抗体抗体A-待测抗原待测抗原-酶标抗体酶标抗体B复合物复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。竞争性反应类型。抗抗 体体 A A待测抗原待测抗原酶标抗体酶标抗体包被物包被物2 2，间接法测定抗体，间接法测定抗体此法常用于测定抗体此法常用于测定抗体将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原抗原-待待测抗体测抗体-酶标二抗的复合物酶标二抗的复合物，复合物的形成量，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。抗抗 原原待测抗体待测抗体酶标二抗酶标二抗包被物包被物3 3，竞，竞 争争 法法此法既可用于检测抗原和半抗原，此法既可用于检测抗原和半抗原，也可以用于检测抗体也可以用于检测抗体用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。度与待测物含量成反比。限量的的抗体限量的的抗体酶标抗原酶标抗原 样品抗原样品抗原酶标多于样品酶标多于样品显色程度深显色程度深样品多于酶标样品多于酶标显色程度浅显色程度浅显色程度与待测物含量成反比显色程度与待测物含量成反比包被物包被物4 4，捕获法（反向间接法），捕获法（反向间接法）主要用于测定血清中某种抗体亚成分主要用于测定血清中某种抗体亚成分以目前最常用的以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性种抗原的特异性IgM和和IgG同时存在，而后者可同时存在，而后者可干扰干扰IgM的测定。因此，先针对的测定。因此，先针对IgM的第二抗体的第二抗体(如羊抗人如羊抗人IgM链抗体）连接于固相载体，用以链抗体）连接于固相载体，用以“捕获捕获”样品中所有样品中所有IgM；洗涤除去；洗涤除去IgG等无关等无关物质，然后加入特异性抗原与待测物质，然后加入特异性抗原与待测IgM结合；再结合；再次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二抗抗-IgM-抗原抗原-酶标抗体复合物，加酶底物显色后，酶标抗体复合物，加酶底物显色后，即可对待即可对待IgM进行定性和定量测定。进行定性和定量测定。针对针对IgM的第二抗体的第二抗体待测物待测物 其中含有其中含有IgM和和IgG特异性抗原与特异性抗原与IgM结合结合酶标抗体酶标抗体包被物包被物IgGIgG等无关物质等无关物质被洗脱被洗脱具具 体体 步步 骤骤l 包被包被l 封闭封闭l 加待测物加待测物l 加一抗，二抗加一抗，二抗，或抗原等，或抗原等l 显色显色包包 被被l 用用包被液包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶稀释包被抗体至合适浓度，包被酶联板（聚乙烯微量反应板），每孔联板（聚乙烯微量反应板），每孔100。l用保鲜膜包好用保鲜膜包好，4过夜。过夜。如急用，包被如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好后，清洗也可用，但最好 过夜。过夜。l 次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。l 用用PBST洗液，洗洗液，洗45次。次。每次在每次在洗板机洗板机清洗酶联板上震荡清洗酶联板上震荡23min后，后，在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。包包 被被 液液0.05M PH 9.6 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液Na2 2CO3 3 1.59 g ；NaHCO3 3 2.93g ；加蒸馏水至加蒸馏水至1000mlPBST 洗洗 液液2000ml PBS +1ml Tween-20PBS：NaCl 8g ；KCl 0.2g；Na2 2HPO4 4 1.42g；KH2 2PO4 4 0.27g；加加1000ml蒸馏水定容，调蒸馏水定容，调PH至至7.4洗洗 板板 机机封封 闭闭l用用封闭液封闭液封闭，每孔封闭，每孔100。室温下，在微量振荡器上，封闭室温下，在微量振荡器上，封闭2h。l弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。l 用用PBST洗液，洗洗液，洗45次。（同包被）次。（同包被）l 用保鲜膜包好，用保鲜膜包好，4可保存一个月。可保存一个月。封封 闭闭 液液l 10%10%小牛血清小牛血清 （1ml1ml小牛血清加到小牛血清加到9ml 1PBS9ml 1PBS中混匀）。中混匀）。l 5%5%脱脂奶粉（用洗液稀释）脱脂奶粉（用洗液稀释）加标准样及样品加标准样及样品l 待测样或标准一抗：待测样或标准一抗：用用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔洗液进行稀释到适合浓度，每孔100l，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育上孵育2小时。清洗。小时。清洗。l 二抗：二抗：用用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔洗液进行稀释到适合浓度，每孔100l，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育上孵育1小时。清洗。小时。清洗。注注 意意l 抗体抗原反应比较快，一般抗体抗原反应比较快，一般1212个小时就个小时就达到峰值。延长反应时间容易出现非特异达到峰值。延长反应时间容易出现非特异结合，但反应时间不能少于结合，但反应时间不能少于1.51.5小时。小时。l 二抗的使用浓度（一般，二抗的使用浓度（一般，1 1：1000010000稀释）稀释）应当进行预实验确定，二抗的反应时间不应当进行预实验确定，二抗的反应时间不能过长，容易出现非特异反应。一般，反能过长，容易出现非特异反应。一般，反应应40604060分即可。分即可。OPD OPD 显显 色色l临用前取临用前取A A液液5.14ml5.14ml，B B液液 4.86ml4.86ml加入加入OPD(OPD(邻苯二胺，在邻苯二胺，在-20-20中保存）中保存）0.0040g0.0040g（约（约4 4小片），溶解后加入小片），溶解后加入50l50l的的30%H30%H2 2OO2 2，配成显色液。（，配成显色液。（OPDOPD要充分混要充分混匀，否则容易出现个别孔颜色太深）匀，否则容易出现个别孔颜色太深）l 显色液每孔显色液每孔100l100l。避光显色。避光显色1520min1520min。l 用用2mol2molL HL H2 2SOSO4 4终止反应，每孔终止反应，每孔50l50l显显 色色 液液l A液：液：0.2mol L Na2HPO4 Na2HPO412H2O 71.7g加水至加水至1000mll B液：液：0.1 mol L 柠檬酸柠檬酸 柠檬酸柠檬酸 19.2g 柠檬酸，加水至柠檬酸，加水至1000ml结结 果果 判判 定定酶标测定仪检测（酶标测定仪检测（429nm429nm），），测定测定ODOD值：值：待测孔（待测孔（P P）与对照孔（）与对照孔（NN）的比值（）的比值（P P：NN）大于）大于1.51.5或或2 2者为阳性者为阳性注意：要有阴性，阳性对照注意：要有阴性，阳性对照。应应 用用ELISA ELISA 法由于测定灵敏、特异、操作简便、法由于测定灵敏、特异、操作简便、酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反射性污染，且易与其他相关技术偶联，使射性污染，且易与其他相关技术偶联，使其成为目前应用最广泛而且发展最快的一其成为目前应用最广泛而且发展最快的一种免疫测定技术。市场上符合质量要求的种免疫测定技术。市场上符合质量要求的商品试剂盒（提供有包装好的固相载体、商品试剂盒（提供有包装好的固相载体、酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成分）和自动或半自动检测仪不断研究发明分）和自动或半自动检测仪不断研究发明问世，极大地促进了问世，极大地促进了ELISAELISA测定技术的普及。测定技术的普及。所有血清学试验要注意所有血清学试验要注意l 为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂中必须至少有一个试剂是可检测的纯品中必须至少有一个试剂是可检测的纯品l 必须有一种分离方法使得结合的标记物与没必须有一种分离方法使得结合的标记物与没有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异性结合的百分比。性结合的百分比。谢谢大家！谢谢大家！