PCR技术(3-LMJ)'.ppt

基因操作基因操作第七章第七章GeneManipulating*1第二节第二节PCR 技术的原理与应用技术的原理与应用Polymerase Chain Reaction江黎明江黎明江黎明江黎明 2013201320132013年年年年10101010月月月月*2Kary B.Mullis（1944）http:/ PCR(polymerase chain reaction)技技术术是是19851985年年由由美美国国科科学学家家Kary B Mullis发发明明的的体体外外基基因因片片段段扩扩增增的方法。的方法。一、一、PCR技术的产生技术的产生*3PCRPCR技术的创建技术的创建Kary B.MullisKary B.Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美）（穆利斯（美）（穆利斯（美）1971197119711971年年年年,KhoranaKhorana等提出在体外等提出在体外等提出在体外等提出在体外DNADNADNADNA经变性经变性经变性经变性,与适当引与适当引与适当引与适当引 物杂交后用物杂交后用物杂交后用物杂交后用DNADNADNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸聚合酶延伸聚合酶延伸,克隆克隆克隆克隆DNADNADNADNA的设想。的设想。的设想。的设想。1983198319831983年年年年,MullisMullis发明了发明了发明了发明了PCRPCRPCRPCR技术。技术。技术。技术。1988198819881988年年年年,SaikiSaiki等将耐热等将耐热等将耐热等将耐热DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(Taq)(Taq)(Taq)(Taq)引入引入引入引入PCRPCRPCRPCR技。技。技。技。1989198919891989年年年年,美国美国美国美国ScienceScience杂志列杂志列杂志列杂志列PCR PCR PCR PCR 为十余项重大科为十余项重大科为十余项重大科为十余项重大科 学发明之首学发明之首学发明之首学发明之首,比喻比喻比喻比喻1989198919891989年为年为年为年为PCRPCRPCRPCR爆炸年。爆炸年。爆炸年。爆炸年。1993199319931993年年年年,MullisMullis荣获度诺贝尔化学奖。荣获度诺贝尔化学奖。荣获度诺贝尔化学奖。荣获度诺贝尔化学奖。*4二、二、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理DNADNA模板变性模板变性 (denature)(denature)：95 95左右高温使模板左右高温使模板DNADNA完全变性。完全变性。单链单链DNADNA模板与引物退火模板与引物退火 (annealing)(annealing)：5555左右引物与模板形成复合物的几率左右引物与模板形成复合物的几率DNADNA分子自身的复性。分子自身的复性。引物的延伸引物的延伸 (extension)(extension)：72 72左右耐热左右耐热DNADNA聚合酶在最适温度下聚合酶在最适温度下催化催化DNADNA合成反应。合成反应。*55 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCRPCR技术的基本原理示意图技术的基本原理示意图TaqTaq酶酶TaqTaq酶酶*6Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，次循环后，PCR PCR的扩增倍的扩增倍数为数为(1+x)(1+x)n n,x=75%,n,x=75%,n为循环数。为循环数。*7DNA PolymerasedNTPsPCR buffer,Mg2+PrimersTemplate DNA PCR PCR体系的体系的5 5种基本组成成分种基本组成成分*8PCR反反应应循循环环变性变性9395C左右左右延伸延伸酶最适温度酶最适温度退火退火引物引物Tm-5C 经过经过3030个左右的循环后，个左右的循环后，模板模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。*9思考题思考题 1 PCRPCR技术的主要特点技术的主要特点1.特异性强特异性强 2.灵敏度高灵敏度高 3.简便快速简便快速 4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低*10u衡量衡量PCR好坏的参数：好坏的参数：特异性特异性Specificity:最好最好只有目的只有目的DNA带。带。真实性真实性Fidelity:DNA序序列正确。列正确。产量产量Q Quantity:DNA带明带明亮。亮。*11思考题思考题 2 利用利用特异性引物特异性引物以以cDNAcDNA或基因组或基因组DNADNA为模为模 板获得已知目的基因片段。板获得已知目的基因片段。利用利用简并引物简并引物从从cDNAcDNA文库或基因组文库中文库或基因组文库中 获得具有一定同源性的基因片段。获得具有一定同源性的基因片段。利用利用随机引物随机引物从从cDNAcDNA文库或基因组文库中文库或基因组文库中 随机克隆基因。随机克隆基因。u 用不同引物进行用不同引物进行PCRPCR获取目的基因：获取目的基因：三、三、PCRPCR技术的主要用途及其衍生技术技术的主要用途及其衍生技术（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆*12(reverse transcription PCR,RT-PCR)1.1.反转录反转录PCR技术技术 特点：特点：敏感度高、特异性强、省时等。敏感度高、特异性强、省时等。RT-PCR是从组织细胞中获得目的基因、对已知是从组织细胞中获得目的基因、对已知 序列序列RNA进行定性及半定量分析最的有效方法。进行定性及半定量分析最的有效方法。总总RNA(或或mRNA)ss-cDNAds-cDNAPCR扩增扩增*13u 获取目的基因的特殊获取目的基因的特殊PCRPCR技术：技术：RT-PCR原理原理AAnATTnT 55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1双链双链cDNAcDNA35 35 5加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR大量的产物大量的产物*14-actin 433bp HIF-1 359bp300 bp500 bp400 bp300bp500bp400bp200bp-actin433bpVEGF238bpRT-PCR的结果举例的结果举例*15限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 感染大肠杆菌感染大肠杆菌 7 Kb DNA 片段片段 cos LR cos7 Kb 外源外源 cDNA 片段片段 cDNA文库文库gt10/11gt10/11gt10/11gt10/11系列系列系列系列 (插入型，适用于插入型，适用于插入型，适用于插入型，适用于cDNAcDNAcDNAcDNA克隆克隆克隆克隆)c DNA 片段片段 1/28/2023 8:53 AM16重组噬菌体重组噬菌体cDNAcDNACCCCCCCC锚定锚定PCRPCRCCCCCCCC末端核酸末端核酸转转移移酶酶CCCC CCCC 锚锚定引物定引物3GGGG3GGGG553GGGG3GGGG5 5 3GGGG3GGGGCCCCCCCC 先先合合成成第第一一链链cDNAcDNA后后,添添加加一一同同聚聚物物尾尾(polydG),(polydG),与与带带有有polydC polydC 限限制性内切位点的制性内切位点的3 3锚定引物一起扩增。锚定引物一起扩增。*17原理：原理：设计设计“内、外内、外”两对引物：两对引物：2.2.巢式巢式-PCR（nested-PCR）先用外引物进行先用外引物进行PCR反应，从模板上扩增出反应，从模板上扩增出含有内引物扩增的靶序列的较长产物，并以此作含有内引物扩增的靶序列的较长产物，并以此作为模板用内引物进行第二次为模板用内引物进行第二次PCR反应，扩增出内反应，扩增出内侧的较短靶序列。侧的较短靶序列。外引物外引物对应的序列在模板的外侧；对应的序列在模板的外侧；内引物内引物对应的序列在外引物的内侧。对应的序列在外引物的内侧。*18第第1轮轮PCR：1520个循环的标准扩增。个循环的标准扩增。第第2轮轮PCR：将第：将第1轮轮PCR扩增产物稀释扩增产物稀释1001000倍，倍，作为模板进行第作为模板进行第2轮轮PCR，扩增，扩增1520个循环。个循环。*19 降降低低了了多多个个靶靶位位点点扩扩增增的的可可能能性性，因因与与2套套引引物物都都互互补补的的靶靶序序列列很很少少。如如用用相相同同引引物物对对作总数相同的循环，会扩增非特异性靶点。作总数相同的循环，会扩增非特异性靶点。可可增增加加有有限限量量靶靶序序列列(如如稀稀有有mRNA)mRNA)的的灵灵敏敏度，并且提高了困难度，并且提高了困难PCR(PCR(如如5 RACE)5 RACE)的特异性。的特异性。用外、内用外、内2 2对引物扩增，可大大提高扩增的对引物扩增，可大大提高扩增的灵敏度和特异性。灵敏度和特异性。*203.cDNA3.cDNA末端快速扩增末端快速扩增*213-RACE*225-RACE5-capAAAAAAAAAA3mRNAGSP11.逆转录逆转录去除RNA和GSP12.末端转移酶末端转移酶3CCCCC3CCCCC3.退火，退火，PCRGSP25GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3Xho l Sal I ClaI3CCCCC5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3CCCCCGSP25GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGXho l Sal I ClaI3.PCR用限制性内切酶切割克隆即获得用限制性内切酶切割克隆即获得5末端片段末端片段*23*24已知序列已知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶连接酶连接酶4.4.反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段对片段对某个已知某个已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。*25电泳电泳负极负极正极正极 测序反应测序反应 GATC*2，3双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸*用用4种不同荧光标记种不同荧光标记 DNADNA样样品品 引物、引物、DNADNA聚合聚合酶酶、dNTPdNTPddGddAddTddC5 3 AACGTGGACddTCCGATTT TTGCACCTGAGGCTAAAAAC GTGGACTAACGTGGAddCAACGTGGddAddAAddAAAddCAACGddTAACddGAACGTddGAACGTGddGu末端合成终止法测定末端合成终止法测定DNADNA序列的原理序列的原理DNA自动测序结果自动测序结果*27TheNobelPrizeinChemistry1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids,with particular regard to recombinant-DNAfor their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acidsPaul Berg1/2 of the prizeStanford University Stanford,CA,USA1926-Walter Gilbert Frederick Sanger1/4 of the prize 1/4 of the prizeHarvard University,Biological Laboratories Cambridge,MA,USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom1932-1918-*28（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变 利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外进行基因的嵌和、缺失、点突变等改造。进行基因的嵌和、缺失、点突变等改造。利利用用PCR技技术术构构建建重重组组体体和和突突变变体体的的方方法称为法称为重组重组PCR(recombinant PCR)。特特点点是是简简单单、省省时时；利利用用两两对对引引物物很很容容易的在易的在DNA片段的任何位置进行点突变。片段的任何位置进行点突变。*291.随机突变：随机突变：应用：应用：策略：易错策略：易错PCR（error-prone PCR）。）。利利用用Taq Taq DNADNA聚聚合合酶酶等等没没有有3535校校对对功功能能的的特特性性，在在PCRPCR扩扩增增反反应应中中可可能能掺掺入入错误的核苷酸，产生随机错误的扩增产物。错误的核苷酸，产生随机错误的扩增产物。加加入入ITPITP并并限限制制某某一一种种核核苷苷酸酸用用量量，从从而而促促进进DNADNA聚聚合合酶酶选选择择其其它它3 3种种核核苷苷酸酸或或ITPITP，导致产物发生突变。，导致产物发生突变。构构建建突突变变体体文文库库，继继而而可可从从中中筛筛选选出出具具有有特特殊性质的突变个体殊性质的突变个体*302.2.定点点突变定点点突变(1)5(1)5端引入点突变：端引入点突变：(2)(2)序列中的点突变：序列中的点突变：通通过过修修饰饰上上游游引引物物的的5 5端端的的碱碱基基序序列列，可可引引入入标标记记的的碱碱基基、限限制制性性酶酶切切位位点点、启启动动子序列等。子序列等。采用重叠延伸采用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR(Overlap Extension PCRPCR，OE PCROE PCR。*31PCR 用酶用酶A A和和B B消化、克隆，将突变位点引入消化、克隆，将突变位点引入PCRPCR重组体。重组体。(1)末端引入点突变末端引入点突变ABP2P1AB*32EcoRIHindIIIIsolate products,mixAmplifydigest,subclone sequencePvuII(2)(2)序列中的点突变：序列中的点突变：*33例子：例子：S.pn的的ply146aa缺失的突变序列构建缺失的突变序列构建肺炎链球菌肺炎链球菌S.Pn的的ply为一细胞毒性分子，其为一细胞毒性分子，其146位位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：首先设计首先设计4 4个引物：个引物：(M1(M1和和M2M2完全重叠完全重叠)P1:5P1:5-CGGGATCCCGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3ATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH IBamH IP2:5P2:5-CCGCTCGACCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3GCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I Xho IM1:5M1:5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3 3M2:5M2:5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 3 *34突变位点突变位点M2M1P2P1555335为酶切位点序列为酶切位点序列1.1.以基因组以基因组DNADNA为模板，以为模板，以P1P1和和M1M1为引物扩增出为引物扩增出plyply上游片断，以上游片断，以P2P2和和M2M2为引物扩增出为引物扩增出plyply下游片断；下游片断；2.2.以上下游片断为模板，以以上下游片断为模板，以P1P1和和P2P2为引物扩出全长；为引物扩出全长；3.3.酶切后克隆到质粒中保存。酶切后克隆到质粒中保存。*35ABP1P2P3P4PCRABPCRAB3.3.引入大片段缺失引入大片段缺失*364.4.多位点突变多位点突变策略：多次重叠策略：多次重叠PCRPCR关键：重叠引物设计关键：重叠引物设计(每对均需部分重叠，方向相反每对均需部分重叠，方向相反)。*37基基本本操操作作*38（三）（三）DNADNA的微量分析的微量分析 PCRPCR技技术术敏敏感感度度很很高高，理理论论上上只只要要存存在在1 1分分子子的的模模板板，就就可可以以获获得得目目的的片片段段，是是DNADNA微微量分析的最好方法。量分析的最好方法。实际工作中，实际工作中，1滴血液、滴血液、1根毛发或根毛发或1个细个细胞已足以满足胞已足以满足PCR的检测需要。的检测需要。*39（四）（四）mRNAmRNA的含量分析的含量分析 用用于于RNA检检测测的的常常用用字字方方法法有有原原位位杂杂交交、点点杂杂交交、Northern印印迹迹杂杂交交及及核核酸酸酶酶保保护护试试验验等等，都都难难以检测低丰度的以检测低丰度的mRNA，且操作繁琐。，且操作繁琐。在在敏敏感感性性方方面面，RT-PCR用用于于mRNA定定量量分分析析要远高于上述传统方法。要远高于上述传统方法。RT-PCRRT-PCR用于用于mRNAmRNA定量分析面临的问题：定量分析面临的问题：在在第第一一步步合合成成cDNA的的反反应应中中会会造造成成一一些些误误差差，但是更重要和显著的误差是由但是更重要和显著的误差是由PCR反应本身造成。反应本身造成。*40u用于定量用于定量PCRPCR分析的两种技术：分析的两种技术：竞争性定量竞争性定量PCRPCR：在在反反应应前前加加入入外外源源标标准准品品RNA作作为为内内参参照照；须须使使用用与与样样品品RNA同同样样的的引引物物识识别别序序列列，但但产产物物的的大大小小不不同，以在电泳时区别开。同，以在电泳时区别开。属属反反应应终终点点分分析析方方法法，需需用用系系列列稀稀释释标标准准RNA做做成标准曲线，样品成标准曲线，样品RNA的含量应在标准曲线范围内。的含量应在标准曲线范围内。实时实时PCR(real time PCR)PCR(real time PCR)：是是近近年年发发展展起起来来的的一一种种RNA微微量量分分析析技技术术；精精确确度高，结果明确，操作容易，能进行高通量检测。度高，结果明确，操作容易，能进行高通量检测。*41u实时实时PCRPCR的基本原理的基本原理 在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。不同公司的仪器和反应系统所用的荧光报告系不同公司的仪器和反应系统所用的荧光报告系统不同：统不同：Molecular Probe 公司的公司的SYBR Green 系统系统Perkin-Elmer/ABD公司的公司的TaqMan系统系统Invitrogen公司的公司的Molecular Beacons系统系统*42原理原理原理原理:PCR扩扩 增增 时时，TaqTaq酶酶的的5 5-3 3外外切切酶酶活活性性将将探探针针酶酶切切降降解解，使使探探针针上上的的荧荧光光基基团团和和淬淬灭灭基基团团分分离离，使使荧荧光光基基团团在在激激发光作用下发出荧光；发光作用下发出荧光；每每扩扩增增一一条条DNA链链就就有有一一个个荧荧光光分分子子形形成成，实实现现了了荧荧光光信信号号的的累累积积与与PCR产产物物形成完全同步。形成完全同步。*43思考题思考题 31.1.实时荧光实时荧光PCRTaqMan技术技术RQ5353ExcitationRQQRQRExcitation实时荧光实时荧光PCRPCRTaqMan技术技术*44TaqManTaqMan技术技术的优、缺点的优、缺点优点：优点：杂交效率高杂交效率高缺点：缺点：(2)(2)探针的水解依赖于探针的水解依赖于TaqTaq的酶外切活性，的酶外切活性，故受酶性能和试剂质量影响；故受酶性能和试剂质量影响；(3)(3)检测点突变的能力相对不足。检测点突变的能力相对不足。(1)(1)淬灭难以彻底，本底较高；淬灭难以彻底，本底较高；*45RQExcitationRQQRExcitationEmission2.2.实时荧光实时荧光PCRPCR分子信标分子信标技术技术*46分子信标分子信标技术技术的优、缺点的优、缺点优点：优点：荧荧光光本本底底低低。荧荧光光基基团团和和淬淬灭灭基基团团极极端端靠靠近近；淬淬灭灭基基团团为为非非荧荧光光物物质质，不不存存在在对对供供体体荧荧光光测测定定的的干干扰扰，荧荧光光淬淬灭彻底。灭彻底。缺点：缺点：设设计计时时需需要要同同时时考考虑虑探探针针和和臂臂的的熔熔点点，增加了难度。增加了难度。*47SYBRSYBRGreenGreenI I是是一一种种只只与与双双链链DNADNA小小沟沟结结合合的的染染料料，当当它它与与DNADNA双双链链结结合合时时，发发出出荧荧光光；从从DNADNA双双链链上上释释放放出出来来时时，荧荧光光信号急剧减弱。信号急剧减弱。因因此此，在在一一个个体体系系内内，其其信信号号强强度度代代表了双链表了双链DNADNA的量。的量。3.3.实时荧光实时荧光PCRPCRSYBR Green I SYBR Green I 技术技术*48SYBRSYBRGreenGreenI I荧光染料的作用原理荧光染料的作用原理 *49SYBR Green I SYBR Green I 技术的优、缺点技术的优、缺点优点：优点：技术简单、方便，而且可适用于任何技术简单、方便，而且可适用于任何PCRPCR反应；反应；缺点：缺点：非特异性结合。非特异性结合。SYBR Green I 也可也可与非特异性的双链结合如引物二聚体，与非特异性的双链结合如引物二聚体，非特异性非特异性PCRPCR扩增产物等扩增产物等*50荧光曲线 随随着着PCRPCR反反应应的的进进行行，扩扩增增产产物物不不断断累累积积，荧荧光光信信号号强强度度不不断断增增加加。每每经经过过一一个个循循环环，收收集集一一次次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图4.4.实时定量实时定量PCRPCR的定量原理的定量原理*51荧光阈值荧光阈值 在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准度标准(即即PCRPCR扩增产物量的标准扩增产物量的标准)。阈值线阈值线u实时定量实时定量PCRPCR的两个重要概念的两个重要概念*52CtCt值的概念值的概念 Ct Ct值的定义是值的定义是PCRPCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物(荧光荧光信号信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。到达阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)值值C(t)值值18.12+/0.04-阈值线阈值线*53浓度低浓度低浓度低浓度低浓度高浓度高浓度高浓度高模板起始浓度越高，模板起始浓度越高，Ct值越小值越小CtCt值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？哪个样品浓度高？*54CtCt值的重现性极好值的重现性极好为为什么用什么用Ct值值而不用而不用终终点相点相对荧对荧光光强强度定量度定量？*55阈值的选择阈值的选择 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可设定在指数扩增阶段任意位置一个值，它可设定在指数扩增阶段任意位置上；上；缺省设置一般是缺省设置一般是3-153-15个循环的荧光信号的个循环的荧光信号的标准偏差的标准偏差的1010倍。倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑系数等参数来综合考虑 *56荧光强度循环数曲线荧光强度循环数曲线初初始始模模板板量量对对数数C(T)循循环数标准曲线环数标准曲线.未知未知10410310610510210 定量原理：定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线准曲线,通过未知样品的通过未知样品的CtCt值值,从标准曲线上计算出该样从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。品的起始浓度。*57unknown104103Unknown contains 3108 copies 首首先先确确定定未未知知样样品品的的 C(t)C(t)值值，借借助助标标准准曲曲线线由由未未知知样样品品的的C(t)C(t)值值反反推推出出其其初初始始量量得得到到未未知知样样品品初初始始量绝对值。量绝对值。*58*59 2.2.衡衡量量PCRPCR好好坏坏的的参参数数主主要要有有哪哪些些？一一般般来来说说好的结果如何体现？好的结果如何体现？思考题：思考题：3.3.以以TaqMan技技术术为为例例，简简述述实实时时荧荧光光PCRPCR的的原理。原理。1.PCR1.PCR过过程程中中的的DNADNA模模板板变变性性、模模板板与与引引物物退退火火、引引物物延延伸伸3 3步步的的温温度度设设置置一一般般大大致致是是多多少少？要要考虑的主要因素是什么？考虑的主要因素是什么？