分子病理学技术进展及临床应用课件.ppt

分子病理学技术进展及临床应用分子病理学技术进展及临床应用(第一部分第一部分)来自临床的问题来自临床的问题Contemporary Understanding of Carcinogenesis by molecular biology as our introductionMore than 100 years ago(1830),British physician Thomas Hodgkin discovered a type of Lymphoma with his naked eyes.In the time,obviously Thomas Hodgkin did never know R-S cells in his cases before the microscope available in clinic.While at present time,for us,what can be down with our naked eyes rather then with microscope or modern molecular techniques?lThe cellular elements in lymphoid&hematopoietic tumors are the key to understand and diagnose their diseases.lEven more,the molecules in the related cells are the key,especially involved in the development and differentiation of lymphoid&hematopoietic cellslThat is the beginning of our story today.Understanding of Lymphocyte Development 1950s-20101.structure and function of lymphoid tissueGermenal Center(GC)Germenal Center(GC)：structurestructure，functionfunction，transformation transformation Capsular and afferent lymphaticsCortexCortexMedullaHilus Efferent lymphatic vesselsTrabeculaeMedullary sinusesMedullary cordsG CFollicleThymus-depending zone Subcapsular sinus Reticulum supporting lymphatic tissueCould you recognize the following cellular elements in lymph node?Germinal centerMantle zoneMarginal zone T-zone Understanding based on 70s of last CenturyInterfollicle zoneT lymphocyteT lmmunocyteB lmmunocyteLymphocyte transform in center of FollicleMemory cellPlasma cell Paradigm of Lymphocyte transformB lymphocyteFDCB non-cleaved cellB cleaved cellOnly by morphologyCentroblastBlastImmuoblastMacrophageFDCCentrocyteT cellMacrophageFDCLennerts Presumption based on 80s of last CenturyGerminal centerDark zoneLight zoneMantle zone Mantle zone Marginal zone Proliferation zoneSelected for apoptosisOn-going mutationby morphology and immunotyping considering molecular eventsUpdate to B-lymphocyte development model in 2000sB cell differentiation by immuno-markers B cell differentiation with anatomical sites of various stages Could you recognize cellular elements as follows in lymph node?Germinal centerMantle zoneMarginal zone T-zone Understanding of B cell differentiation until 2005 by H SteinNaive B cellDCSomatic Hypermutation/Affinity MaturationClass SwitchingIGM IgG,IgAMemory B cellPlasma cellApoptosisGerminal CenterGerminal CenterV(D)J recombinationApoptosisAntigenDCCentroblastsCentrocytesBone MarrowPost-Germinal Post-Germinal CenterCenterBBBBBBBBBBTTPrecursorB LymphoblastBCL2 IRF4 BCL2 BCL6 Decreased AffinityIncreased AffinityBCL6 No BCRT cell-rich zoneIntact BCR?IgHVclonal rearrangementsomatic hypermutation!lWhat happen to T cell since it has been less mentioned The contemporary understanding of B and T cell differentiation2009-2010Understanding of the lymphocyte differentiation and transformation by multiple approaches inl.morphology,immunotyping and molecular means.一、临床分子病理学常用方法一、临床分子病理学常用方法l免疫组织化学免疫组织化学l基因克隆性重排的检测基因克隆性重排的检测lFISH及CGHl等位基因不平衡分析l杂合性缺失（LOH）的检测l微卫星DNA不稳定性（MSI）的检测For post-graduate program Clinical pathology-ZR-201509（一）免疫组织化学及其应用（一）免疫组织化学及其应用1 1免疫组织化学的相关理论和技术免疫组织化学的相关理论和技术 1 11 1免疫组织化学的工作原理免疫组织化学的工作原理 l 已知的特异性抗体或抗原能特异性结合已知的特异性抗体或抗原能特异性结合l 通通过过化化学学反反应应使使标标记记于于结结合合后后的的特特异异性性抗抗体体上上的的显显示示剂剂，如如酶酶，金金属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）l 借借助助显显微微镜镜、荧荧光光显显微微镜镜或或电电子子显显微微镜镜观观察察其其颜颜色色变变化化，从从而而在在抗抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构原抗体结合部位确定组织、细胞结构For post-graduate program Clinical pathology-ZR-2 22 2免疫组织化学的应用范围及优点：免疫组织化学的应用范围及优点：2 22 21 1应用范围：应用范围：(1)(1)提高病理诊断准确性提高病理诊断准确性 (2)(2)对疾病的预后和治疗的意义对疾病的预后和治疗的意义 激素激素 (3)(3)癌基因蛋白的应用癌基因蛋白的应用 (4)(4)对肿瘤增生程度的评价对肿瘤增生程度的评价 ki-67ki-67,PCNA,PCNA (5)(5)微小病灶的发现微小病灶的发现 微小癌，微小病灶（如微小癌，微小病灶（如羊水栓塞羊水栓塞）(6)(6)在肿瘤分期上的意义在肿瘤分期上的意义 (7)(7)指导肿瘤的治疗指导肿瘤的治疗 (8)(8)免疫性疾病的辅助诊断免疫性疾病的辅助诊断 (9)(9)病原微生物的检测病原微生物的检测For post-graduate program Clinical pathology-ZR-2014 2 2常用免疫组织化学方法：常用免疫组织化学方法：A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法 间接法 金银法 PAP和BigBee APAAP ABC法 EnVision法 BT法（CSA：Catalyzed signal amplification）1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000,1:106 E.E.ABCABC法法 F.EnVision近年来的新方法近年来的新方法:G.CSAG.CSA法（Catalyzed signal amplification）BT法For post-graduate program Clinical pathology-ZR-20120910 CSACSA原理图原理图CSA法H.免疫组化免疫组化-原位杂交的原位杂交的联合应用联合应用I.TUNEL-免疫组化在细胞凋亡检测免疫组化在细胞凋亡检测中的应用中的应用 凋亡是一个基因调控、耗能的主动过程，也称之为程凋亡是一个基因调控、耗能的主动过程，也称之为程序性细胞死亡序性细胞死亡(programmed cell death(programmed cell death，PCD)PCD)。凋亡是单个细胞或数个细胞的死亡，死亡细胞的质凋亡是单个细胞或数个细胞的死亡，死亡细胞的质膜膜(细胞膜和细胞器膜细胞膜和细胞器膜)不破裂，不引发死亡细胞的自溶，不破裂，不引发死亡细胞的自溶，也不引起急性炎症反应。也不引起急性炎症反应。l形态学特点：形态学特点：电镜下电镜下，凋亡的细胞皱缩，质膜完，凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集、不同程整，胞浆致密，细胞器密集、不同程度退变；核染色质致密，形成形状不度退变；核染色质致密，形成形状不一、大小不等的团块边集于核膜处，一、大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解、胞浆多发性芽突；胞进而胞核裂解、胞浆多发性芽突；胞浆芽突迅速脱落，形成许多浆芽突迅速脱落，形成许多凋亡小体凋亡小体（apoptotic bodiesapoptotic bodies）。凋亡小体外）。凋亡小体外被以胞膜，其胞浆中含有细胞器，核被以胞膜，其胞浆中含有细胞器，核碎片可有可无。凋亡小体迅即在局部碎片可有可无。凋亡小体迅即在局部被巨噬细胞和相邻的其他细胞被巨噬细胞和相邻的其他细胞(例如上例如上皮细胞皮细胞)吞噬、降解。细胞凋亡和细胞吞噬、降解。细胞凋亡和细胞坏死的超微形态比较。坏死的超微形态比较。光镜下光镜下，凋亡细胞胞浆浓缩，强，凋亡细胞胞浆浓缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片，嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片，故有称之为故有称之为嗜酸性小体嗜酸性小体（councilman councilman bodiesbodies）。）。l生化特点：生化特点：由基因调控，是耗能的主动过程由基因调控，是耗能的主动过程 CaCa2+2+/Mg/Mg2+2+依赖的核酸内切酶活化依赖的核酸内切酶活化 DNADNA断裂以核小体为单位断裂以核小体为单位 DNADNA电泳呈阶梯状图谱电泳呈阶梯状图谱TUNELTUNEL法检测凋亡法检测凋亡（Terminal Deoxynucleotidyl TransferaseTerminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick-end-mediated dUTP nick-end-labling labling）TdTTdT介导的介导的dUTPdUTP缺口末端标记缺口末端标记TdTTdT酶酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)末端脱氧核苷酸转末端脱氧核苷酸转移酶（移酶（TUNELTUNEL）TUNELTUNEL法示意法示意间接法：间接法：Digoxigenin-dUTPDigoxigenin-dUTPTUNELTUNEL染色：直接法染色：直接法参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：（1 1）切片脱蜡至水，双蒸水、）切片脱蜡至水，双蒸水、PBSPBS液洗；液洗；（2 2）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（0.01M0.01M，PH6.0PH6.0）的容器中微波加热）的容器中微波加热.（3 3）PBSPBS液洗液洗 5min5min3 3次；次；（4 4）每张切片滴加）每张切片滴加20ug20ugmlml蛋白酶蛋白酶K K液，放于湿盒中液，放于湿盒中3737孵育孵育15min15min；（5 5）切片置于）切片置于0.3%H0.3%H2 2O O2 2-甲醇液中室温放置甲醇液中室温放置20-25min20-25min；（6 6）滴加）滴加TUNELTUNEL反应混合液，反应混合液，3737湿盒中孵育湿盒中孵育60-90min60-90min；TUNELTUNEL反应混合液主要成分：反应混合液主要成分：Bio-11-dUTPBio-11-dUTP TdT TdT酶酶（7 7）PBSPBS液洗液洗5min5min3 3次；次；（8 8）滴加链霉菌素）滴加链霉菌素辣根过氧化物酶液（用辣根过氧化物酶液（用PBSPBS液稀释成液稀释成1:2001:200）3737湿盒中孵育湿盒中孵育30min30min，（9 9）滴加新鲜配制的）滴加新鲜配制的DAB-HDAB-H2 2O O2 2液，镜下观察液，镜下观察2-10min2-10min显色；显色；（1010）自来水充分洗涤；）自来水充分洗涤；免疫组化多重标记的应用免疫组化多重标记的应用以以EnVisionEnVision方法为例方法为例For post-graduate program Clinical pathology-ZR-2014 免疫组化多重标记的应用免疫组化多重标记的应用在淋巴瘤研究中的应用在淋巴瘤研究中的应用1.1.ABC-DAB/SAB-AP-vector blueABC-DAB/SAB-AP-vector blue示：示：CD30+H/RSCD30+H/RS细胞表达细胞表达P53 P53、BCL-2BCL-22.2.ABC-DAB/SAB-AP-vector redABC-DAB/SAB-AP-vector red示：示：H/RSH/RS细胞、细胞、T T细胞和细胞和B B细胞的分布情况。细胞的分布情况。3.3.TUNEL-DAB/SAB-AP-vector redTUNEL-DAB/SAB-AP-vector red示示:CD30+H/RSCD30+H/RS细胞细胞4 4免疫组织化学的质量控制及方案设计免疫组织化学的质量控制及方案设计4 41 1AbAb的保存和配制的保存和配制 保存性分装保存性分装 即用型即用型 配制：选最佳点配制：选最佳点4 42 2正确的设计和结果判断正确的设计和结果判断1.1.试剂对照试剂对照确定第一抗体和第二抗体是否具有抗原特异性。其中要确定第一抗确定第一抗体和第二抗体是否具有抗原特异性。其中要确定第一抗体对阳性组织的最佳稀释度；第二抗体对组织蛋白的无反应性。体对阳性组织的最佳稀释度；第二抗体对组织蛋白的无反应性。l阴性试剂对照阴性试剂对照：用一个阴性试剂替代一抗或控制步骤用一个阴性试剂替代一抗或控制步骤 目的：目的：用来评价非特异性染色，并较好解释抗原部位的特异性标记。用来评价非特异性染色，并较好解释抗原部位的特异性标记。For post-graduate program Clinical pathology-ZR-2014 2.2.组织对照组织对照l阴性组织对照阴性组织对照：例如例如:正常肝组织用于对照正常肝组织用于对照HBsAgHBsAg阳性的肝细胞检测阳性的肝细胞检测 再再者者,如如果果大大规规模模使使用用抗抗体体，一一张张切切片片的的阴阴性性区区，可可能能就就是是另另一一张张切片（不同切片（不同AbAb）的非特异性染色对照。）的非特异性染色对照。l阳性组织对照阳性组织对照：有已知的、含目标抗原的样本有已知的、含目标抗原的样本目的：目的：监控抗原是否存在；监控抗原敏感性是否丧失。监控抗原是否存在；监控抗原敏感性是否丧失。l组织内对照组织内对照：可以消除不同组织间固定造成的差异，另一个优点是可以不使用阳性可以消除不同组织间固定造成的差异，另一个优点是可以不使用阳性对照标本。对照标本。阴性试剂对照阴性试剂对照阴性组织对照阴性组织对照阳性组织对照阳性组织对照组织内对照组织内对照研究组研究组+-+-定位定位+/-+/-+/-+/-理论预期理论预期实测值实测值非定位非定位意义意义？For post-graduate program Clinical pathology-ZR-20130909 BIGBEEBIGBEE图图结果判断标准结果判断标准由于影响因素很多，如不同厂家生产的同一种抗体特异性和由于影响因素很多，如不同厂家生产的同一种抗体特异性和敏感性的差异、所用的检测试剂盒特异性和敏感性的差异、技术敏感性的差异、所用的检测试剂盒特异性和敏感性的差异、技术熟练程序以及固定包埋等，其结果判断的标准化问题尚难统一。熟练程序以及固定包埋等，其结果判断的标准化问题尚难统一。有一些原则必须掌握：有一些原则必须掌握：l阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性l间质清晰，无背景着色。间质清晰，无背景着色。免疫组化的免疫组化的定量问题定量问题l阳性细胞要在阳性细胞要在5%5%以上，才能定为阳性。以上，才能定为阳性。l参考评价：参考评价：50%+5 5临床病理学免疫组化临床病理学免疫组化 “套餐套餐”式标记：式标记：5 51 1临床病理学常用临床病理学常用“套餐式标记套餐式标记”选用选用 Keratin Keratin Vimentin Vimentin S-100 S-100 LCA leukocyte common antigen LCA leukocyte common antigen方案一方案一方案二方案二方案三方案三可疑神经内分泌肿瘤 CgA NSE 蛙皮素蛙皮素 方案四方案四思考复习题思考复习题1.1.请结合自己的专业，简单设计一个免疫组织化学标记的方请结合自己的专业，简单设计一个免疫组织化学标记的方案来研究一个课题案来研究一个课题.(.(一抗和二抗的名称和来源、一抗的定一抗和二抗的名称和来源、一抗的定位预测；实验方案、生物学意义和临床意义、实验设计位预测；实验方案、生物学意义和临床意义、实验设计（每个对照组的意义）、结果判断。（每个对照组的意义）、结果判断。2.2.免疫组化的应用范围免疫组化的应用范围3.何谓何谓“套餐式套餐式”免疫标记免疫标记?举两例说明举两例说明6.6.免疫组化应用范围及免疫组化应用范围及应用应用”盲点盲点”。