植物花粉花药培养.ppt

第六章第六章 植物花粉花药培养植物花粉花药培养Riceandrogenesis.一、花粉及花药培养一、花粉及花药培养（Pollen Culture and Pollen Culture and Anther CultureAnther Culture）离体条件下对植物的花粉或花药进行培养获得单倍离体条件下对植物的花粉或花药进行培养获得单倍体植株的技术。体植株的技术。最早是在最早是在19641964年由印度植物学家年由印度植物学家Guha Guha 和和MaheshiwariMaheshiwari在毛叶曼佗罗（在毛叶曼佗罗（Datura innoxia)Datura innoxia)的花药的花药培养中成功获得单倍体植株。培养中成功获得单倍体植株。目前已在目前已在250250多种植物中由花药或花粉培养获得单多种植物中由花药或花粉培养获得单倍体植株。倍体植株。www.desicca.de/./hauptteil_figure_85.html（1 1）基础理论上研究的利用）基础理论上研究的利用（2 2）单倍体育种）单倍体育种 A.A.获得纯合二倍体；获得纯合二倍体；B.B.缩短育种年限；缩短育种年限；C.C.远缘杂种的培育；远缘杂种的培育；D.D.与诱变育种结合获得新品种。与诱变育种结合获得新品种。花粉花药培养的技术应用：花粉花药培养的技术应用：（一）花药培养（一）花药培养:Anthercultureistheprocessofusingantherstoculturehaploidplantlets.固体培养固体培养液体培养液体培养 A.A.液体培养：液体培养：B.B.双层培养：双层培养：C.C.分步培养：分步培养：D.D.条件培养：条件培养：1 1、培养方式：、培养方式：2.2.培养条件：培养条件：（1 1）培养基类型）培养基类型MSMS、MillerMiller、NitshNitsh、H H、N6N6、W14W14等。等。（2 2）激素及生长调节剂）激素及生长调节剂 早期要求生长素促进分裂，早期要求生长素促进分裂，后期细胞分裂素促进后期细胞分裂素促进花粉植株的形成。花粉植株的形成。（3 3）碳源及其他成分）碳源及其他成分 高浓度蔗糖等，要求较低的铵态氮、氨基酸等。高浓度蔗糖等，要求较低的铵态氮、氨基酸等。（4 4）温度和光照：）温度和光照：前期要求高温，光照条件要求前期要求高温，光照条件要求不高。不高。醋酸洋红染色镜检花粉发育时期。大多数醋酸洋红染色镜检花粉发育时期。大多数植物以单核后期花粉适宜花药培养。植物以单核后期花粉适宜花药培养。3.3.选择适宜的花粉发育时期：选择适宜的花粉发育时期：4.4.花粉植株的诱导：花粉植株的诱导：（1 1）胚状体途径）胚状体途径 直接形成胚状体直接形成胚状体（2 2）愈伤组织途径）愈伤组织途径 形成愈伤组织然后分化出不定芽等器官，最后形成愈伤组织然后分化出不定芽等器官，最后发育成完整植株。发育成完整植株。Figure-Segmentationpatternofin vitrowheatpollenobservedfromthe1stto14thdayofantherculture.Thefigureshowsthatauninucleatedmicrosporemaydegeneratebeforedivision,(a)ormaygiverise,bymitosis,tonormalbinucleatedgrainpresentingvegetativeandgenerativenuclei(b).Identicalnucleiareformedinlowfrequency(c).Thefirstmitoticdivisionoccursatthe4thdayofculture.Thenormalbinucleatedpollenmayfollowthenormalin situdevelopmentalpatternformingstarchandthen,degenerate(d).Thesecondmitoticdivisiontakesplaceatthe6-8thandatthe10thdayofculture.Intheandrogeneticpollen,thevegetative,generativeorbothnucleiareabletodividegivingrisetoanembryo(e,f,g).Inpollenwithidenticalnuclei,bothcellscontributetoandrogenesis(h).Pollendegenerationcanoccurinanystepofthisprocess.Atthe14thday,multicellularstructurescanbeseen(i).Figure-Syntheticmodelforandrogenesis.Stressoperatingattwochangingpointscanmodifythenormaldevelopmentofpollengrain,thatbecamecompetentforembryogenesis.Thispotentialwouldbedependentonsporophyticinformationkeptinthecytoplasm,whichnormallyareeliminatedatmeiosisandattheuninucleatedvacuolatestageofpollengrain.Figure-P-pollenwithtwoidenticalnuclei.Figure-Wheatp-pollenin vivoshowingseveralnucleisimilartomulticellularstructuresin vitro.离体小孢子发育途径（雄核发育，离体小孢子发育途径（雄核发育，AndrogenesisAndrogenesis）：）：A A途径：小孢子第一次途径：小孢子第一次不均等分裂不均等分裂。根据第二次及以后的分裂不同又分为：根据第二次及以后的分裂不同又分为：A-V A-V：营养核分裂；：营养核分裂；A-G A-G：生殖核分裂；：生殖核分裂；A-VG A-VG：营养和生殖核均分裂；：营养和生殖核均分裂；C C：分裂中出现融合加倍等现象等。：分裂中出现融合加倍等现象等。B B途径：小孢子第一次途径：小孢子第一次均等分裂均等分裂 形成大小相似的细胞，然后有单一类细胞组成多核形成大小相似的细胞，然后有单一类细胞组成多核花粉细胞。花粉细胞。（1 1）自然加倍：）自然加倍：自发形成二倍体，愈伤组织途径较多发生。自发形成二倍体，愈伤组织途径较多发生。（2 2）人工加倍：）人工加倍：利用秋水仙素等利用秋水仙素等化学药剂处理单倍体化学药剂处理单倍体植株加倍。使用浓度植株加倍。使用浓度0.0006%-3%,0.0006%-3%,以以0.2%0.2%应用较普遍。应用较普遍。此外，抗微管形成的除草剂也可以用于染色体加倍，此外，抗微管形成的除草剂也可以用于染色体加倍，如如OryzalinOryzalin、trifluralintrifluralin、APMAPM等。等。5.5.单倍体植株的加倍：单倍体植株的加倍：6.6.单倍体植株的倍性鉴定：单倍体植株的倍性鉴定：单倍体单倍体35.5%35.5%，二倍体，二倍体53.4%53.4%，多倍体，多倍体5.2%5.2%鉴定方法：鉴定方法：（1 1）染色体直接技术法：）染色体直接技术法：需对根尖或茎尖细需对根尖或茎尖细胞染色体进行显微观察鉴定。胞染色体进行显微观察鉴定。（2 2）间接鉴定法：）间接鉴定法：植株形态鉴定、细胞形态植株形态鉴定、细胞形态鉴定、流式细胞仪鉴定、高低温胁迫鉴定、杂鉴定、流式细胞仪鉴定、高低温胁迫鉴定、杂交鉴定、分子标记鉴定等。交鉴定、分子标记鉴定等。（二）花粉培养：（二）花粉培养：花粉培养是将花粉从花药中分花粉培养是将花粉从花药中分离出来成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉启动离出来成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉启动脱分化，进而发育成完整植株的一种技术脱分化，进而发育成完整植株的一种技术,易获得单倍易获得单倍体植株。体植株。1.1.材料的预处理：材料的预处理：花粉培养中材料的预处理方法有花粉培养中材料的预处理方法有黑暗处理黑暗处理、光照光照处理、高渗处理处理、高渗处理（蔗糖、甘露醇等）（蔗糖、甘露醇等）、药物处理药物处理（秋（秋水仙素、乙稀利、水仙素、乙稀利、EMSEMS等）等）、温度处理以及射线处理、温度处理以及射线处理（r r射线）射线）等。等。温度处理又包括温度处理又包括低温处理和高温处理低温处理和高温处理，接种前的，接种前的处理和接种后的处理等，采用较多的方式是把取来的处理和接种后的处理等，采用较多的方式是把取来的材料放在冰箱里材料放在冰箱里310 310 0 0C C下进行下进行115115天天的低温处理。的低温处理。也常采用接种后预处理的方法。也常采用接种后预处理的方法。2.2.材料的消毒与无菌操作：材料的消毒与无菌操作：与悬浮细胞培养相似，要求高。与悬浮细胞培养相似，要求高。3.3.花粉的分离与清洗：花粉的分离与清洗：(1)(1)花药漂浮培养自然释放法：花药漂浮培养自然释放法：把花药接种在液体把花药接种在液体培养基上，花药漂浮于液体表面经培养基上，花药漂浮于液体表面经1717天的培养，天的培养，药壁开裂，花粉自然散落下来及时将花药壁从培药壁开裂，花粉自然散落下来及时将花药壁从培养瓶小取出来，留下的花粉继续培养。养瓶小取出来，留下的花粉继续培养。(2)(2)机械分离法机械分离法 A.A.分离：分离：把花药放在玻璃容器中，加入一定量适把花药放在玻璃容器中，加入一定量适当浓度的蔗糖溶液，直接加入适量液体培养基，用当浓度的蔗糖溶液，直接加入适量液体培养基，用注射器内径轻轻挤压花药把花粉挤出来。或用磁力注射器内径轻轻挤压花药把花粉挤出来。或用磁力搅拌器把花药搅裂使花粉散出来。搅拌器把花药搅裂使花粉散出来。B.B.过筛：过筛：把上述的花药残渣和花粉的混合液经把上述的花药残渣和花粉的混合液经一定孔径的不锈钢网或尼龙网过滤。花粉滤液注入一定孔径的不锈钢网或尼龙网过滤。花粉滤液注入离心管。离心管。C.C.清洗：清洗：花粉药壁混合液置于花粉药壁混合液置于100100一一10001000转分转分的速度下离心的速度下离心11一一5 5分钟，上清夜再离心，最后悬分钟，上清夜再离心，最后悬浮花粉。密度为浮花粉。密度为10104 4-10-105 5/ml/ml。4 4花粉培养方式：花粉培养方式：（1 1）直接培养法：）直接培养法：不经预处理直接接种于培养基。不经预处理直接接种于培养基。（2 2）看护培养法：）看护培养法：花药接种于培养基，上面放置花药接种于培养基，上面放置一块滤纸，花粉接种于滤纸上。一块滤纸，花粉接种于滤纸上。（3 3）微室培养法）微室培养法:盖玻片上滴加一滴琼脂，花粉盖玻片上滴加一滴琼脂，花粉接种在琼脂上，反向放置于凹型载玻片上。接种在琼脂上，反向放置于凹型载玻片上。2007 2007年年4 4月月3030日日