I型超敏反应实验设计.ppt
IL-12IL-12抗抗I I型超敏反应的实验探究型超敏反应的实验探究1实验目的实验目的l1.验证IL-12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用。l2.探究IL-12的注射剂量对下调IgE的影响。l3.探讨IL-12在治疗I型超敏反应中的前景。实验原理实验原理 IgE的产生依赖于细胞因子IL-4，Th2细胞受变应原刺激活化分泌IL-4等细胞因子,可诱导变应原特异性B细胞增殖、分化成浆细胞，通过调节Ig类别转换等机制产生特异性IgE抗体。IL-12可刺激NK细胞分泌IFN-，并诱导Th0向Th1细胞方向分化，抑制向Th2细胞分化，减少Th2细胞以及其生成的IL-4。同时，IFN-还具有抑制B细胞合成IgE的潜在活性。从而可以达到下调IgE的效果。IFN-是Th1的特征性细胞因子，IL-4是Th2的特征性细胞因子。利用酶联免疫吸附法（ELISA)检测致敏大鼠脾淋巴细胞分泌IFN-、IL-4的表达水平,以及血浆中IgE的水平。即可验证IL-12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用。IL-12刺激Th2向Th1转化，下调IgE实验原理实验原理ELISAELISA原理原理l双抗夹心法双抗夹心法l测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。实验原理实验原理l动物：Wistar大鼠12只,体重200220 g，雄雌各半，随机分5组，即正常组1只、模型组1只、实验组10只。l药物:鼠IL-12l试剂：鸡卵白蛋白,抗鼠1gE抗体，抗鼠IL-4抗体，抗鼠IFN-抗体，酶标抗体，底物，生理盐水。l仪器:微孔板，酶标分析仪，离心机。实验材料实验材料实验流程实验流程l1、分组l2、变应原的制备与注射l3、外周血采集及IL-4、IFN-、IgE的测定 （ELISA）l4、数据分析1、正常组：1只 未经处理的对鸡卵清蛋白不过敏 的wistar大鼠2、模型组：1只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠3、实验组：10只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠 ps：模型组和实验组均是用鸡卵白蛋白与氢氧化铝悬液的混合液致敏和诱发，制成的型超敏反应动物模型。分组分组1、取50 g鸡卵清蛋白制成5mL 10g/mL的溶液（溶于生理盐水中）2、制备800 g/mL的IL-12，按照下图做倍比稀释（IL-12稀释于鸡卵清蛋白中）药物的制备药物的制备稀释稀释比比1:1:1001001:1:2002001:1:4004001:1:8008001:1:160016001:1:320032001:1:640064001:1:12800128001:1:25600256001:1:5120051200浓度ug/ml16168 84 42 21 10.50.50.250.250.1250.1250.06250.06250.031250.03125 1、正常组不做处理 2、模型组和实验组于致敏两周后,腹腔内注射药物 （鸡卵清蛋白+IL-12）50L药物注射物注射正常组模型组和实验组鸡卵清蛋白IL-1250L1、用眼眶取血法取外周血，离心取上清液外周血采集及IL-4、IFN-、IgE的测定（ELISA）2、ELISA 检测血浆中IL-4、IFN-和IgE的滴度1、包被抗体：抗体（抗鼠IgE抗体）用包被液稀释好后100l/孔加样，37孵育1或者4过夜，之后用超纯水洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。2、封闭：加1%的脱脂奶粉，200l/孔，37放置1或者4过夜，之后甩干，不洗，此时的抗体板子可以直接使用。3、加抗原IgE：每孔加100l需要检测的IgE于已经封闭好的酶标板，小心吹除气泡，37孵育1或者4过夜，之后用PBS洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。4、加酶标抗体：酶标抗体50l/孔加于酶标板，37放置1，之后用PBS洗三遍，必要时要进行适当的浸泡，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。5、显色：显色底物加于酶标板，100l/孔，37孵育15min后用1滴的硫酸终止显色反应。6.重复ELISA实验，检测小鼠血清中IFN-和IL-4的浓度变化7.数据分析，用酶标分析仪读出血清中IgE、IFN-和IL-4的效价ELISAELISA(以以IgEIgE为例例)预期结果预期结果正常组：IL-4、IFN-和IgE水平很低模型组：IgE和IL-4效价较正常明显升高，效价较正常明显降低实验组：特定浓度的IL-12对下调IgE效果最明显IL-4变化趋势与IgE相同,IFN-相反实验讨论实验讨论一、预期外的结果IL-12IL-12浓度过低浓度过低IL-12IL-12浓度过高浓度过高2.模型组致敏成功 个体差异、IL-12和变应原注射顺序、注射和取血距致敏的时间、注射方式、剂量。实验讨论实验讨论效果不明显1.模型组致敏失败 模型组IgE未升高。l二、IL-12与变应原注射顺序不同-致敏前、同时或之后注射IL-12,可能导致不同的结果l三、用以检测IL-4、IFN-和IgE的其他方法：RT-PCR、ELISPOT实验讨论实验讨论前景探究前景探究lIL12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用，因此可以考虑IL-12在治疗I型超敏反应会有一定的应用价值。例如在知道超敏原的前提下可以应用IL-12来避免可预知的过敏。参考文献参考文献l金伯泉.医学免疫学.第五版.北京：人民卫生出版社,2008l周俊宜.分子医学技能.第一版.北京:科学出版社,2006l胡大伟,陈顺乐,石学耕,等Th1/Th2细胞因子的失衡与狼疮活动性的研究中华风湿病学杂志,1999,3(Suppl):8-11l董尉,盛军,浦燕艳,石学耕,史桂英.哮喘患儿细胞内IL-4、INF-和血清IgE测定及临床意义.中国当代儿科杂志,2002,4(2):119-120.l安云芳，赵长青.变应性鼻炎鼻豁膜物质受体的研究J.中华耳鼻喉科杂志，1998，33(3):139一141.l宋宁,丛斌.CCK对Th1_Th2细胞的调节作用及其机制研究.中国病理生理杂志，2007Thank youThank you！
