对象与方法6854.pdf

一、对象与方法 1、调查样本 调查样本涵盖全省 11 个市（地）。2、调查方法 采用随机抽样问卷调查法。调查问卷表格分为 ABCD4 类：A 类表的问卷对象为市（地）及区县卫生局；B 类表的问卷对象为各级医院（包括中医院）；C 类表的问卷对象为乡镇卫生院；D 类表的问卷对象为村卫生院。3、需求预测的参考依据 4、需求测算方法 采用“需求增长指数”测算方法，测算公式为：需求增长指数（未来需求数现有数）/现有数 课堂笔记：1、基本情况的调查报告 研究性和预测性调查报告 分类：普遍调查和非普遍调查 非普遍调查分为：典型、重点、统计、抽样、问卷 2、调查报告的写作要领 一、观点和材料的结合，突出观点 精选典型事例 巧用对比方法 运用精确的数字 二、以叙述事实为主，夹叙夹议 三、叙述和议论是调查报告基本的表达方法，而夹叙夹议 3、调查报告的实施 一、确认调查的方式之前务必要明确的目的是什么？问卷调查、直接采访 二、调查工作计划的实施 A、多少份有效 B、为了达到需要的有效问卷，需要收集多少问卷 C、如何激起调查者参与调查时的积极性 D、需要所少人力，物力 E、调查责任人是谁，相关工作的分工 免疫组化实验过程中的要点和技巧 1.固定：最好用 4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。Bouin S 固定液：饱和苦味酸 750ml，甲醛 250ml，冰醋酸 50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2 组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3 切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4 烤片：60 30 分钟或 37 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5 蜡块及切片的保存：最好在 4 保存 6 脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml 的多聚赖氨酸溶液可按 1:10 稀释成 60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES 和 Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在 APES 1：50 丙酮溶液中浸泡 3 分钟，晾干，即可进行下一步。7 灭活内源性酶：HRP 系统：3%双氧水灭活；AP 系统：3%HAc灭活。8暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。9 封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭 10抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于 PBS稀释的抗体一定要当天使用。11背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含 1 Tween20的 PBS洗，特别是在显色之前要多洗。12返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如 PBS）或 Na2HPO4的饱和溶液返蓝。13 显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。14 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。（一）、仪器设备 1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0,加水至 1000ml。4）1mol/L的 TBS 缓冲液（pH8.0）：在 800ml 水中溶解 121gTris碱，用 1N 的 HCl调至 pH8.0,加水至 1000ml。5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用 0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用 0.1N 的 HCl 配制。6）3%甲醇-H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和 0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合；b、油和 TBS(或 PBS)配制。8）TBS/PBS pH9.09.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4 适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60恒温箱中烘烤 20 分钟。1）组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟；2）无水乙醇中浸泡 5 分钟；3）95%乙醇中浸泡 5 分钟；4）70%乙醇中浸泡 5 分钟；2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入 EDTA（pH8.0）或 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至 95左右，放入组织芯片加热 1015 分钟。（3）微波热修复 在微波炉里加热 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔 510 分钟，反复 1-2 次。2）酶消化方法 常用 0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至 37，切片也预热至 37，消化时间约为 530 分钟；胃蛋白酶消化 37时间为 30 分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN 等。3、免疫组织化学染色 SP法 1）脱蜡、水化；2）PBS洗 2 3 次各 5 分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在 TMA上，室温静置 10 分钟；4）PBS洗 2 3 次各 5 分钟；5）抗原修复；6）PBS洗 2 3 次各 5 分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟。甩去多余液体。8）滴加抗 50 l，室温静置 1 小时或者 4过夜或者 371 小时。9）4过夜后需在 37复温 45 分钟。10）PBS洗 3 次各 5 分钟；11）滴加抗 40 50 l，室温静置，或 371 小时；12）II 抗中可加入 0.05%的 tween-20。13）PBS洗 3 次各 5 分钟；14）DAB显色 510 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗 10 分钟；16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗 10 15 分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法 1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各 5 分钟。3)用蒸馏水或 PBS配置新鲜的 3%H2O2，室温封闭 510 分钟，蒸馏水洗 3 次。4)抗原修复。5)PBS洗 5 分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体。7)滴加抗,室温 1 小时或者 4过夜或者 371 小时（4过夜后在 37复温 45分钟）。8)PBS洗三次每次 2 分钟。9)滴加生物素化二抗,203720 分钟。10)PBC洗 3 次每次 2 分钟。11)滴加试剂 SABC，203720 分钟。12)PBS洗 4 次每次 5 分钟。13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14)蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。15)脱水、透明、封片、镜检。动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。二、实验材料、用品 材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为022m，微孔滤膜(直径90)：孔径为022 m，过滤器(直径25)。药品：70或75 酒精，01新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，05 过氧乙酸，乳酸，37甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水 体积分数01的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)。仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。消毒 1物理消毒法 (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。(2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160，保温90 120 min。用于RNA提取实验的用品则需180，保温5 8 h。(3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20SSC等)。(4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤膜孔径有0 60 m、0 45 m、0 35 m、022 m、010m 等，以022 m 除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为022m。用布包好，湿热灭菌后使用。2 化学消毒法 常用的消毒液有如下几种：(1)70(或75)酒精：超净台里常备70酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。(2)01 新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0 1 新洁尔灭溶液的容器及纱布。(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。(4)05 过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1 3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。(6)37甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1 3 d后方可达到消毒空气的目的。3 煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。细胞的生长阶段及其形态特征 传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：A游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。B吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约78h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25以内有新生细胞。一般要观察35个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。十十：细胞占瓶壁有效面积的2575以内具新生细胞。十十十：细胞占瓶壁有效面积的7595具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。十十十十：细胞占瓶壁95以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。D维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。E衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。文献学 1,就中医古籍的整理与研究，主要应包括以下几项内容：、善本影印。、标点、今译、校勘、注释、类编、史书的编纂。、文献工具书的编纂、中医文献理论的研究 2,文献的基础知识：文献的源流、形式、目录学、版本学等；文献的整理：影印、标点、校勘、注释、考证等；文献的利用（目的）：理解文献等。3,众多的中医文献以文图的形式，记录下数千年积累起来的中医学术理论和临床经验。这些文字记录，是中医知识的主要载体，离开它就无从谈到中医学术。4,在大量中医古籍中，有相当一部分是属临床医学，其中又有两方面内容：一为临床各科理法方药；一为历代医家临床验案与经验体会的实录。5,要探索和研究中医文献的文献学理论和体系，当然可以文史文献学为借鉴，但重要的是通过大量中医文献的整理研究，总结自身的规律，体现本学科的特色。6,医学文献所记载的医学科学，乃是中华民族传统科学文化体系中的一个分支，或者说是总体中的一个部分，必然和科学文化的总体有着不可分割的联系。作为祖国医学的指导思想，特别突出地强调了“人与天地相参”的观点。7,作为中医文献，它不仅是一种综合的科学文化的载体，就其物体本身而论，它又是社会生产、物质生活和多种技能的实际体现和实物证据。8,对原有的古籍作种种加工，目的是使古籍更便于今人和后人阅读利用.对古籍加以注释是为了扫除文字障碍和阐明义理。9,文献学是我国学术界特有的，以中国古代文献为研究对象的一门学科。现代图书情报学所涉及的各种文献问题，一般不称其为文献学或现代文献学（史学界历史文献学、文学界古典文献学、中医中医文献学）。10,文献学 1）以中国古代文献为研究对象。2）是一门研究文献的整理、利用的理论和方法的学科。