动物细胞培养技术优秀PPT.ppt

动物细胞培育技术动物细胞培育技术1.1.动物细胞的生长与培育动物细胞的生长与培育动物细胞的特点动物细胞的特点进化程度高进化程度高结构、形态、成分困难结构、形态、成分困难细胞间连接形式多样细胞间连接形式多样生长相对缓慢生长相对缓慢功能全面功能全面1.1 1.1 培育细胞的生物学特征培育细胞的生物学特征Hepatocytes体外培育细胞的分型体外培育细胞的分型 （一）贴附型（一）贴附型 成纤维细胞型成纤维细胞型 上皮型细胞上皮型细胞 游走细胞型游走细胞型 多形型细胞多形型细胞（二）悬浮型（二）悬浮型（三）半贴壁型（三）半贴壁型（一）贴附型：（一）贴附型：大多数培育细胞贴附生长，属于贴壁大多数培育细胞贴附生长，属于贴壁依靠性细胞依靠性细胞贴附贴附:是大多数有机体细胞在体内生存是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式和生长发育的基本存在方式结果结果:基于贴附特性，使细胞与细胞之基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必需贴附于一固相表面才能多数细胞必需贴附于一固相表面才能生存和生长。生存和生长。培育时：这些细胞被放到体外环境中培育时：这些细胞被放到体外环境中以后以后,同样须要贴附于某一固相表面才同样须要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附贴附(锚定或锚着锚定或锚着)依靠型依靠型(性性)细胞：细胞：唯有贴附于固相表面才能生存的细胞唯有贴附于固相表面才能生存的细胞细胞在体内、外的贴附方式：存在差异细胞在体内、外的贴附方式：存在差异体内：贴附是全方位体内：贴附是全方位,外形具有困难的立体特征外形具有困难的立体特征体外：多数状况，细胞只有一个附着平面，外体外：多数状况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同形一般与体内时明显不同贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料依据培育细胞的主要形态，可分为几大类型依据培育细胞的主要形态，可分为几大类型 1 1、成纤维细胞型：、成纤维细胞型：名称：凡在培育中形态与成纤维细胞类似的名称：凡在培育中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出三角形，胞质向外伸出2323个长短不等的突起，个长短不等的突起，中有卵圆形核中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起2 2、上皮型细胞：、上皮型细胞：名称：仅形态上似体内，事实上不完全相同名称：仅形态上似体内，事实上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍如：皮肤及其衍生物生物,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠生长特点：易相连成片，相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动活动3 3、游走细胞型：、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区分。他细胞相区分。4 4、多型细胞型：、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。可统归于此类。（二）悬浮型：（二）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞简洁大量繁殖。胞简洁大量繁殖。概念：培育时不贴附于底物而呈悬浮概念：培育时不贴附于底物而呈悬浮状态生长状态生长或以机械方法使保持悬浮状态或以机械方法使保持悬浮状态下生长下生长来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团单个或小细胞团优点：生存空间大，供应数量大，传优点：生存空间大，供应数量大，传代便利代便利(不需消化不需消化)，易于收获，可获得稳定状态易于收获，可获得稳定状态缺点：纯化不便利，不能通过离心将缺点：纯化不便利，不能通过离心将死、活细胞分别死、活细胞分别无菌无毒害的环境无菌无毒害的环境1支持生长增殖的养分支持生长增殖的养分2其它类似体内的环境其它类似体内的环境3维持细胞性状维持细胞性状41.2 1.2 细胞培育总原则细胞培育总原则(一一)细胞培育无菌无毒环境细胞培育无菌无毒环境l试验室设计合理试验室设计合理l常用设施及设备常用设施及设备l培育器皿：培育器皿：l 透亮度好、无毒、利于细胞贴附和生长透亮度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。中性硬度玻璃制品。细胞培育无菌操作基本技术细胞培育无菌操作基本技术l工作环境及表面的处理工作环境及表面的处理l细胞培育所用玻璃及塑料制品的处理细胞培育所用玻璃及塑料制品的处理l培育液与培育细胞的处理培育液与培育细胞的处理(二二)细胞的养分细胞的养分l培育基：合适的细胞培育基是体外细胞生长增殖培育基：合适的细胞培育基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培育基不仅供应细胞养的最重要的条件之一，培育基不仅供应细胞养分和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还供分和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还供应培育细胞生长和繁殖的生存环境。应培育细胞生长和繁殖的生存环境。l血清：血清是细胞培育液中最重要的成分之一，血清：血清是细胞培育液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它养分含有细胞生长所需的多种生长因子及其它养分成分成分 。l其它成分（条件培育基）其它成分（条件培育基）合成培育基的主要成分合成培育基的主要成分l氨基酸氨基酸l碳水化合物碳水化合物l无机盐无机盐l维生素维生素l其它协助物质其它协助物质培育基种类培育基种类lRPMI-1640（标准型）（标准型）lDMEM-高糖（标准型）高糖（标准型）lDMEM-低糖（标准型）低糖（标准型）lMcCoys 5AlM199lF12血清血清牛血清、马血清、人血清牛血清、马血清、人血清（1 1）储存于）储存于-20 -70-20 -70 低温冰箱中低温冰箱中（2 2）一般厂商供应的血清为无菌）一般厂商供应的血清为无菌（3 3）热灭活是指）热灭活是指56,30 56,30 分钟加热已完全分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（complementcomplement）灭活）灭活（4 4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心）血清中的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm,5 3000rpm,5 分钟去除，也可不用处理。分钟去除，也可不用处理。其它常用液体试剂其它常用液体试剂lHankslD-HankslPBSlNaHCO3（7.5%）l胰酶溶液（胰酶溶液（0.25%）(三三)其它类似体内的环境其它类似体内的环境n温度温度n气体气体n渗透压渗透压n氢离子浓度氢离子浓度(PH)(PH)n其他其他(四四)合理的支配，维持细胞性状合理的支配，维持细胞性状尽早冻存原代细胞，复苏后状态复原尽早冻存原代细胞，复苏后状态复原的细胞以及转染后稳定存在的细胞的细胞以及转染后稳定存在的细胞须要做试验的细胞要选对数生长期须要做试验的细胞要选对数生长期防止细胞污染，如遇污染，刚好处理防止细胞污染，如遇污染，刚好处理一、细菌污染一、细菌污染细菌污染是试验室细胞培育中常见的污染，细菌污染是试验室细胞培育中常见的污染，即使在细即使在细胞培育液中加入了抗菌素胞培育液中加入了抗菌素(一般为预防剂量一般为预防剂量)，也可能，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。氏阳性菌。培育细胞受细菌污染后，会出现培育液变混培育细胞受细菌污染后，会出现培育液变混浊，浊，pHpH改改变。也有的培育液肉眼视察无多少变更，只变。也有的培育液肉眼视察无多少变更，只能在镜下能在镜下发觉菌体才知污染。所以，每天应细致视察。发觉菌体才知污染。所以，每天应细致视察。污染后污染后细胞发生病理变更，胞内颗粒增多、增粗，细胞发生病理变更，胞内颗粒增多、增粗，最终变圆最终变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系系)丢失。丢失。二、真菌污染二、真菌污染真菌污染是细胞培育过程中最常见的一种，真菌污染是细胞培育过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节尤其在霉雨季节进行细胞培育更易污染。最常见的真菌有烟进行细胞培育更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培育细胞受真菌污染后，可见培育液中漂移培育细胞受真菌污染后，可见培育液中漂移着白色或浅黄色的着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培育液一般不发生混小点，有的散在生长，培育液一般不发生混浊；倒置显微镜下浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝犬牙交织在可见丝状、管状或树枝状的菌丝犬牙交织在细胞之间或培育基细胞之间或培育基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培育瓶看时，要将培育瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最终混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最终由于养分耗尽及毒由于养分耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。性作用而使细胞脱落死亡。三、支原体污染三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微最小微生物，最小直径生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去，一般过滤除菌无法去除除它，光镜下难以看清它的形态结构。起先不它，光镜下难以看清它的形态结构。起先不易发易发现，能在偏碱条件现，能在偏碱条件(pH7.68.0)下生存，对青下生存，对青霉素霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中心电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中心有电子有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。培育细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可培育细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细但多数细胞污染后无明显变更，或略有变更，若不刚胞污染后无明显变更，或略有变更，若不刚好处理，好处理，还会产生交叉污染。还会产生交叉污染。四、病毒污染四、病毒污染接受组织细胞培育法生产疫苗，假如没有除接受组织细胞培育法生产疫苗，假如没有除去潜在去潜在病毒的组织培育物，会产生病毒污染。目前，病毒的组织培育物，会产生病毒污染。目前，从原从原代猴肾细胞的培育中已发觉不少于代猴肾细胞的培育中已发觉不少于20种血清种血清性病毒。性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培育，但生尽管病毒污染的细胞不影响原代培育，但生产疫苗产疫苗是担忧全的。若二倍体细胞系有是担忧全的。若二倍体细胞系有SV40或多发或多发瘤病瘤病毒，毒，B淋巴细胞含淋巴细胞含EB病毒，细胞会发生变异、病毒，细胞会发生变异、转转化，形成异倍体的细胞系。化，形成异倍体的细胞系。五、非同种细胞污染五、非同种细胞污染由于细胞培育操作时各细胞株所需的器材和由于细胞培育操作时各细胞株所需的器材和溶液没溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一被另一种细胞污染。如种细胞污染。如“灵长类灵长类”细胞系发觉猴和细胞系发觉猴和鼠类细胞鼠类细胞的混合物，的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分别出细胞是从兔肾中分别出来的，来的，而现在却认为是而现在却认为是HeLa细胞。细胞。非细胞培育物所造成的化学成分的污染也偶非细胞培育物所造成的化学成分的污染也偶有发有发生，大多是由于细胞培育所需物品清洗消毒生，大多是由于细胞培育所需物品清洗消毒不彻底不彻底而带入一些有毒化学物质所致。而带入一些有毒化学物质所致。常用的解除微生物污染的方法常用的解除微生物污染的方法 u抗生素解除法：接受抗生素解除法：接受510倍于常用量的冲击法，加入高浓倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用度抗生素后作用2448h，再换入常规培育物，有时可能奏，再换入常规培育物，有时可能奏效。效。u加温除菌：依据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的加温除菌：依据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的细胞至于细胞至于41摄氏度作用摄氏度作用510h（最长可达（最长可达18h），以杀灭支），以杀灭支原体。原体。u动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内，利用动物的免疫功能歼灭污染的微生物，而肿瘤细腹腔内，利用动物的免疫功能歼灭污染的微生物，而肿瘤细胞却能在动物体内接着生长，待确定时间后从体内取出肿瘤胞却能在动物体内接着生长，待确定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培育细胞进行培育u与巨噬细胞共培育：巨噬细胞在体外可存活与巨噬细胞共培育：巨噬细胞在体外可存活710天，并保天，并保持吞噬、消化微生物的实力。利用这一特点，可将少量的污持吞噬、消化微生物的实力。利用这一特点，可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培育，从而消退污染。染细胞与足够量的巨噬细胞共培育，从而消退污染。1.3 1.3 培育细胞的生长和增殖过程培育细胞的生长和增殖过程 幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培育单个细胞细胞细胞悬液悬液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养如何界定原代培育和传代培育；如何界定原代培育和传代培育；多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质变更遗传物质变更遗传物质未变更遗传物质未变更l原代培育：从机体取出后马上培育的原代培育：从机体取出后马上培育的细胞为原代细胞。培育的第细胞为原代细胞。培育的第1 1代细胞与代细胞与传传1010代以内的细胞称为原代细胞培育。代以内的细胞称为原代细胞培育。l传代培育：将原代细胞从培育瓶中取传代培育：将原代细胞从培育瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培育瓶中接着培育，称或两个以上的培育瓶中接着培育，称为传代培育。为传代培育。有关概念有关概念细胞的原代培育细胞的原代培育 将动物机体的各种组织从机体中取出，经将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTAEDTA）或机械方法处理，分散成单细）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培育基中培育，使细胞得以胞，置合适的培育基中培育，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培育。生存、生长和繁殖，这一过程称原代培育。组织块干脆培育法（机械法）组织块干脆培育法（机械法）1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置、取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡酒精泡23秒钟秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。平皿中。2、用、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（、用手术剪将肝脏剪成小块（1-2mm），再用），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中液洗三次，转移至小青霉素瓶中4、将组织块转移到培育瓶，贴附与瓶底面、将组织块转移到培育瓶，贴附与瓶底面5、翻转瓶底朝上，将培育液加至瓶中，培育液勿接触、翻转瓶底朝上，将培育液加至瓶中，培育液勿接触组织块。入组织块。入37静置静置35小时，轻轻翻转培育瓶，使小时，轻轻翻转培育瓶，使组织浸入培育液中（勿使组织漂起），组织浸入培育液中（勿使组织漂起），37接着培育接着培育 胰酶消化法胰酶消化法1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置、取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡酒精泡23秒钟秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。平皿中。2、用、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入、视组织块量加入56倍的倍的0.25%胰酶液，胰酶液，37中消中消化化2040分钟，每隔分钟，每隔5分钟振荡一次分钟振荡一次.5、加入、加入2ml培育液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑培育液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。用吸管吹打，冲散细胞。6、静置，使未分散的组织块下沉。、静置，使未分散的组织块下沉。7、吸取上层细胞悬液，转移到两个培育皿中，补加适、吸取上层细胞悬液，转移到两个培育皿中，补加适量培育液，量培育液，37下培育。下培育。（一）培育细胞生命期（一）培育细胞生命期在培育中持续增殖和生长的时间。在培育中持续增殖和生长的时间。1 1原代培育期：原代培育期：从体内取出组织从体内取出组织,接种培育到第一次传代接种培育到第一次传代阶段（初代培育）阶段（初代培育）特点：特点：1 1一一4 4周、细胞呈活跃的移动、可见周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相像性、多呈二倍体核型原组织相像性、多呈二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。即细胞独立生存性差。2 2传代期：传代期：初代培育细胞一经传代后便改称做细胞初代培育细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培育条件较好状况下，细胞增殖旺盛，在培育条件较好状况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培育期或传代后胞性质，细胞应在初代培育期或传代后早期冻存。一般状况下当传代早期冻存。一般状况下当传代10105050次次左右，细胞增殖渐渐缓慢，以至完全停左右，细胞增殖渐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。止，细胞进入第三期。3 3衰退期：衰退期：此期细胞仍旧生存，但增殖很慢或不增此期细胞仍旧生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增加，最终衰退凋亡。殖；细胞形态轮廓增加，最终衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数状况下，在以在细胞生命期阶段，少数状况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。细胞可能发生自发转化。转化的标记之一是细胞可能获得永生性转化的标记之一是细胞可能获得永生性或恶性性。或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获长久性增殖细胞永生性也称不死性，即细胞获长久性增殖实力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连实力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在其次续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在其次期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。胞永生性和恶性性非同一性状。（二）组织培育细胞一代生存期（二）组织培育细胞一代生存期所谓细胞“一代”一词，系指从细胞接种到分别再培育时的一段时间，这已成为培育工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：潜藏期潜藏期指数生长期指数生长期停滞期停滞期1 1潜藏期：潜藏期：过程过程:游离游离:悬浮悬浮,胞质回缩胞质回缩,全部细胞变为圆全部细胞变为圆球形球形吸附吸附:贴附底物贴附底物,一般一般2424小时内贴壁小时内贴壁潜藏期潜藏期:可有运动活动可有运动活动,基本无增殖基本无增殖,少少见分裂相见分裂相 影响因素：影响因素：潜藏期的长短与：潜藏期的长短与：细胞种类细胞种类接种的细胞密度接种的细胞密度培育条件培育条件1.1.细胞类型细胞类型传代培育的细胞之潜藏期比原代培育的细胞短。传代培育的细胞之潜藏期比原代培育的细胞短。传代培育期的细胞传代培育期的细胞6-24h;6-24h;原代原代24-96h24-96h或更长或更长单个细胞快单个细胞快,细胞大团慢细胞大团慢,组织块慢组织块慢连续细胞系与发生恶性转化的细胞连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)(6-24h)比有比有限细胞系与正常二倍体细胞的短限细胞系与正常二倍体细胞的短来源：胚胎组织来源：胚胎组织:短短,2,2天可见细胞生长，成体天可见细胞生长，成体:长长 2.2.细胞密度细胞密度密度越大、数量越多，细胞群体越简洁密度越大、数量越多，细胞群体越简洁适应体外环境，潜藏期就短。相反，即适应体外环境，潜藏期就短。相反，即便是在很小的培育空间内，如接种的细便是在很小的培育空间内，如接种的细胞数量不够大，潜藏期仍会较长胞数量不够大，潜藏期仍会较长3.3.培育条件培育条件培育液、培育液、pHpH 底物、污染底物、污染,有毒有毒 2 2指数增生期：指数增生期：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标记。一般以细胞分裂指数表示，即细标记。一般以细胞分裂指数表示，即细胞群中每胞群中每10001000个细胞中的分裂相数。一个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于般细胞的分裂指数介于0.1%0.1%0.5%0.5%，初，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达胞分裂指数可高达3%3%5%5%。特点：特点：是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段培育物中细胞数量呈指数增长培育物中细胞数量呈指数增长,细胞群细胞群体均一体均一是志向的试验用细胞是志向的试验用细胞接触抑制接触抑制密度抑制密度抑制3 3停滞期：停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（再增加，故也称平台期（PlateauPlateau）。）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培育液中养分渐趋耗尽，代动，继而培育液中养分渐趋耗尽，代谢产物积累、谢产物积累、pHpH降低。此时需做分别降低。此时需做分别培育即传代，否则细胞会中毒，发生培育即传代，否则细胞会中毒，发生形态变更，重则从底物脱落死亡形态变更，重则从底物脱落死亡特点特点 (1)(1)细细胞胞数数量量：细胞达饱和密度，出现密度抑制。细胞达饱和密度，出现密度抑制。(2)(2)细胞活动小细胞活动小(3)(3)生长组分下降生长组分下降 (4)(4)刚刚好好传传代代：细细胞胞已已中中毒毒，即即使使传传代代，也会影响下一代细胞的功能状况也会影响下一代细胞的功能状况潜藏期潜藏期指数生长期指数生长期停滞期停滞期细胞计数及活力测定细胞计数及活力测定l培育的培育的细胞在一般条件下要求有确定的密度胞在一般条件下要求有确定的密度才能生才能生长良好，所以要良好，所以要进行行细胞胞计数，数，结果果以每毫升以每毫升细胞数表示。胞数表示。l在在细胞群体中胞群体中总有一些因各种有一些因各种缘由而死亡的由而死亡的细胞，胞，总细胞中活胞中活细胞所占的百分比叫做胞所占的百分比叫做细胞活力，由胞活力，由组织中分中分别细胞一般也要胞一般也要检查活活力，以了解分力，以了解分别的的过程程对细胞是否有胞是否有损伤作作用。复用。复苏后的后的细胞也要胞也要检查活力，了解活力，了解冻存存和复和复苏的效果。的效果。细胞计数原理细胞计数原理细胞胞计数操作步数操作步骤 1、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充溢盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下视察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000留意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。请计算一下请计算一下细胞毒试验须要效应细胞与靶细胞的比例为细胞毒试验须要效应细胞与靶细胞的比例为2020：1 1且靶细胞须要且靶细胞须要1x104/TEST1x104/TEST。现有效应细胞现有效应细胞10ml10ml，取，取100ul100ul效应细胞加入效应细胞加入900ul900ulPBSPBS中，混匀后记数，细胞浓度为中，混匀后记数，细胞浓度为2x104/ml2x104/ml。靶细胞也有靶细胞也有10ml10ml，经记数，细胞浓度为，经记数，细胞浓度为1x105/ml1x105/ml。效应细胞共有多少？靶细胞共有多少？效应细胞共有多少？靶细胞共有多少？以现有的细胞做试验，能做几个以现有的细胞做试验，能做几个TESTTEST？细胞活力胞活力测定步骤测定步骤1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个随意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透亮状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。哺乳动物细胞冷冻保存哺乳动物细胞冷冻保存主要目的：主要目的：（1 1）保存种子细胞，以便随时取用。）保存种子细胞，以便随时取用。（2 2）降低人力和物力）降低人力和物力（3 3）削减细胞被微生物污染的危急性。）削减细胞被微生物污染的危急性。（4 4）避开有限细胞系出现苍老或恶性转变）避开有限细胞系出现苍老或恶性转变（5 5）削减细胞因传代培育而引起的遗传变异）削减细胞因传代培育而引起的遗传变异和形态变更和形态变更冷冻保存要点冷冻保存要点（1 1）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟控降温仪，按每分钟-1-1 到到-3-3速度降温，始速度降温，始终到终到-80-80以下，然后干脆放入液氮中长期保以下，然后干脆放入液氮中长期保存存（2 2）冻存细胞必需处在对数生长期，活力大于）冻存细胞必需处在对数生长期，活力大于9090，无微生物污染。，无微生物污染。（3 3）细胞浓度限制在：）细胞浓度限制在：110611061107/ml1107/ml。（4 4）运用高浓度血清（）运用高浓度血清（30%30%）（5 5）运用合适的细胞冷冻爱护剂（）运用合适的细胞冷冻爱护剂（DMSODMSO、甘油）、甘油）细胞冷冻保存液主要成分：冷冻爱护剂（细胞冷冻保存液主要成分：冷冻爱护剂（5-5-10%10%，培育基（，培育基（60%60%），血清（），血清（30%30%）。）。细胞冻存好用程序细胞冻存好用程序l收集细胞收集细胞l冻存液重悬分装入冻存管冻存液重悬分装入冻存管106-107/mLl4 40min 40minl-20 30-60 min-20 30-60 minl-30 30min-30 30minl-80 -80 过夜过夜l液氮罐保存并记录液氮罐保存并记录冷冻保存细胞的解冻与复苏冷冻保存细胞的解冻与复苏（1 1）快速解冻）快速解冻（2 2）解冻操作过程动作要轻）解冻操作过程动作要轻特殊留意：特殊留意：解冻时务必留意平安，预防冷冻管爆裂。要带手解冻时务必留意平安，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入3737水浴中。切不行干脆用手，以免冻伤水浴中。切不行干脆用手，以免冻伤冷冻管在水浴中解冻时，液面不行超过冻存管盖冷冻管在水浴中解冻时，液面不行超过冻存管盖面，否则，易发生污染面，否则，易发生污染解冻冷冻保存细胞的离心方法解冻冷冻保存细胞的离心方法:1.1.从液氮中取出冻存的细胞，马上放入从液氮中取出冻存的细胞，马上放入3737水浴水浴中快速解冻。中快速解冻。2.2.将将1 12ml 2ml 冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到25ml 25ml 簇新完全细簇新完全细胞生长培育液中，轻轻混匀。胞生长培育液中，轻轻混匀。3.3.用用80g 80g 离心离心2 23 3 分钟（分钟（800-1000rpm 5min800-1000rpm 5min），），弃上清液。弃上清液。4.4.用完全生长培育液轻轻悬浮细胞团，并计数细用完全生长培育液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。胞。5.5.接种细胞到培育瓶中，起始密度不低于接种细胞到培育瓶中，起始密度不低于3105/ml3105/ml。24-48h 24-48h 后换液。后换液。1.4 1.4 体外培育细胞的种类体外培育细胞的种类 细胞系细胞系细胞株细胞株二倍体细胞二倍体细胞遗传缺陷细胞遗传缺陷细胞肿瘤细胞肿瘤细胞（一）细胞系（一）细胞系初代培育物起先第一次传代培育后的细胞初代培育物起先第一次传代培育后的细胞，即称之为细胞系。，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系胞系已获无限繁殖实力能持续生存的细胞系，已获无限繁殖实力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。称连续细胞系或无限细胞系。（二）细胞株（二）细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分别培育或通过筛选的方法，由细胞分别培育或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分别培育出与原再由原细胞株进一步分别培育出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株株（三）二倍体细胞（三）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占细胞占75或或80以上）的细胞群，称二倍体以上）的细胞群，称二倍体细胞。细胞。如仅数目相同，而核型不同的即染色体如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有变更者为假二倍体。形态有变更者为假二倍体。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或在初代或25代即大量冻存作为原种。代即大量冻存作为原种。（四）遗传缺陷细胞（四）遗传缺陷细胞从有先天遗传缺陷者取材（主要从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培育的细胞，或为成纤维细胞）培育的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。具有二倍体核型，也可呈异倍体。（五）肿瘤细胞系或株（五）肿瘤细胞系或株这是现有细胞系中最多的一类，我国已这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。和异体接种致瘤性。细胞系或细胞株的命名细胞系或细胞株的命名 HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，：宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美国国立卫生探讨院（：美国国立卫生探讨院（National Institute of Health）建立；每）建立；每3天传代，每次天传代，每次接种接种3105细胞毫升。细胞毫升。细胞系或株的鉴定、管理和运用细胞系或株的鉴定、管理和运用 ATCCATCC入库细胞要求检测项目如下：入库细胞要求检测项目如下：:/atcc.org :/atcc.org培育简历：组织来源日期、物种、组织起源、性培育简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异样健康状态、细胞已传别、年龄、供体正常或异样健康状态、细胞已传代数等代数等冻冻 存存 液：培育基和防冻液名称液：培育基和防冻液名称细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性培培 养养 液：培育基种类和名称（一般要求不含抗液：培育基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量生素）、血清来源和含量细胞形态：细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性融解后细胞生长特性核核 型：型：二倍体或多倍体，标记染色体的二倍体或多倍体，标记染色体的有无有无无污染检测：无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等虫和病毒等物种检测：物种检测：检测同工酶，以证明细胞有否交检测同工酶，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测叉污染以及反转录酶检测免疫检测：免疫检测：一两种血清学检测一两种血清学检测细胞建立者：细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名建立者姓名；检测者姓名 细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡:是能量依靠的细胞内死是能量依靠的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀，由基因亡程序活化而致的细胞自杀，由基因限制的细胞自主有序的主动死亡过程。限制的细胞自主有序的主动死亡过程。细胞程序性死亡细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）:指生理性细胞死亡。描述在一个多指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序育中的一个预定的，并受到严格程序限制的正常组成部分。限制的正常组成部分。细胞凋亡与坏死的区分细胞凋亡与坏死的区分坏死坏死 凋亡凋亡1.性质性质 病理性，非特异性病理性，非特异性,非遗传性非遗传性 生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性 遗传性遗传性2.诱导因素诱导因素 猛烈刺激（极端环境），随机发生猛烈刺激（极端环境），随机发生 较弱刺激，非随机发生较