2022年溶液中蛋白质含量测定优秀教案 .docx
精选学习资料 - - - - - - - - - 个人收集整理 仅供参考学习溶液中蛋白质含量地测定学案【试验分析】应用分光光度计等测试仪器定量测定食物中养分物质地含量,是中同学物试验技术地升级.它不仅让同学感悟到生物学讨论技术早就进入科学精准测量时代,而且可以让同学知道自己在课堂中学会地试验技术可以应用到日常生活中,感受学习地乐趣 .“ 溶液中蛋白质含量地测定” 是上海市高中生命科学教材第一册中有关蛋白质含量测定地定量试验,也是高中第一个定量地生物学试验 .【试验原理】1.双缩脲反应：双缩脲 NH3CONHCONH3是两个分子脲经 180 摄氏度左右加热,放出一个分子氨后得到地产物 .在强碱性溶液中,双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应 .凡具有两个酰胺基或两个直接连接地肽键,或通过一个中间碳原子相连地肽键地化合物都有双缩脲反应 .而蛋白质有两个以上地肽键,因此有双缩脲反应 .在碱性溶液中蛋白质与Cu 2+形成紫红色络合物,其颜色深浅与蛋白质地浓度成正比,而与蛋白质地分子量及氨基酸 成 分 无 关 . 2.标准曲线：定量试验是建立在定性试验地基础之上,需要纯物质作为标准样品 .标准曲线法是常用地定量方法,该方法需要配制一组不同浓度地标准溶液,分别测出它们地吸取度,然后以标准浓度（C）为横坐标,以吸取度（A）为纵坐标,即可绘出标准曲线图,曲线为一通过原点地直线 .待测溶液亦经过同样处理,测出它地吸取度,即可从标准曲线查出样 品 地 浓 度 , 再 由 稀 释 倍 数 或 样 品 重 量 求 出 样 品 中 被 测 组 分 地 含 量 . 优点：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简洁,可直接从标准工作曲线上读出含量,因此特别适合于大量样品地分析. 缺点：每次样品分析地条件很难完全相同,因此简洁显现较大误差.此外,标准工作曲线绘制时,一般使用欲测组分地标准样品（或已知精确含量地样品）,而实际样品地组成却千 差 万 别 , 因 此 必 将 给 测 量 带 来 一 定 地 误 差 , 所 以 要 注 意 实 验 地 重 复 性 问 题 . 3.本试验中将结晶牛血清白蛋白配制成（02.5）mg/mL 不同浓度地标准溶液,通过分光光度计或者色度传感器测出它们地吸取度,绘制标准曲线,并通过标准曲线运算待测溶液中地蛋白质含量 .【试验目标】1. 学问目标：能概述双缩脲反应地原理,并简要说出标准曲线法地原理和优缺点2. 才能目标：能照使用方法正确使用刻度移液管；能初步使用分光光度计；能利用仪器所测得地数据正确绘制标准曲线,并通过所绘曲线及公式正确运算出待测溶液地蛋白质含量3. 情感态度与价值观：同学能体会到真实记录试验数据和积极、善于分析地科学试验态度和精神,并在日后地试验或学习过程中践行之 .【试验材料与器具】1.试验材料：结晶牛血清白蛋白,待测样品（稀释100-150 倍地鸡蛋清,稀释100-200 倍地豆浆）2.试验试剂： CuSO4·5H2O,酒石酸钾钠, 10%氢氧化钠,蒸馏水3.试验仪器：分光光度计,试管,试管架,1ml 与 5ml 地刻度移液管,玻璃棒,250ml 烧杯, 10ml 容量瓶,记号笔【试验过程】1. 蛋白标准溶液和双缩脲试剂地配置：称取结晶牛血清白蛋白25mg,溶解于蒸馏水并定1 / 4 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 个人收集整理 仅供参考学习容 至 10ml , 制 成 2.5mg/ml浓 度 地 牛 血 清 白 蛋 白 标 准 溶 液 ； 0.75g 五 水 硫 酸 铜（CuSO4· 5H2O）和 3.0g 酒石酸钾钠,用 250ml 蒸馏水溶解,在搅拌下加入 150ml 氢氧化钠溶液,用水稀释到 500ml 即得双缩脲试剂,可长期储存于塑料瓶或内涂有石蜡地试剂瓶中 .2取7支试管,从0依次编号. 3依据下表在试管0-5 中加入牛血清白蛋白标准液及蒸馏水,在试管6 中加入待测液1ml. 4每只试 管 加 入 4ml 双 缩 脲 试 剂 . 5静置 20min,以蒸馏水为空白对比,在 540nm 波长下测定各试管中样品地吸光强度,记 录 O.D 值 . 6 以 O.D 值 为 纵 坐 标 , 蛋 白 质 含 量 为 横 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 . 7 根 据 试 管 6 测 得 地 O.D 值 , 从 标 准 曲 线 中 查 出 其 中 地 蛋 白 质 含 量 . 8蛋白质含量地运算：蛋白质含量（N-稀释倍数 .【试验说明】mg/ml ）=D*N.D- 从标准曲线上查出地蛋白质含量；1. 支配：鉴于时间与空间地关系,届时每组派一名同学共4 名完成标准曲线地试验（0-5号试管溶液地添加）,并用excel 制作标准曲线；其余每组同学可依据自己地需要挑选不同稀释浓度（100-150 之间）地鸡蛋清或豆浆（有爱好地同学当天可自带材料探究,如牛奶等） .2. 留意事项：1） 使用分光光度计时,请务必确认是在 器；每只试管重复测三次540nm 下,使用中轻拿轻放,爱惜试验仪2） 因待测蛋白质稀释溶液需在 0.25-2.5mg 之间,自带材料浓度未知地届时需稀释多个梯度浓度以确定合适地可测范畴,本组供应地材料是经过多次试验探究到地可测蛋白质含量地稀释浓度,请放心使用3） 操作过程务必严谨,稍不留意易导致试验失败 . 3学问拓展：1）经前人试验地不断探究,添加酒石酸钾钠配置地双缩脲试剂不仅较“ 先加 5%NaOH后加 1%CuSO4” 更能增强试验地灵敏度和结果地稳固性,且其可以在塑料瓶或内涂有石蜡地试剂瓶中长期储存 .2）随着科技地进展,蛋白质测定方法地讨论取得较大进步,有多种其比较如下表：方法灵敏度时间原理说明凯氏定氮法较 低 , 适 用 于费时, 8-10h 将蛋白质转化为用于标准蛋白质0.2-1.0mg 氮,用酸吸取后含 量 地 准 确 测滴定定,干扰少,费时太长双缩脲试法较低,适用于1-中速, 8-10h 多 肽 键 + 碱 性用于快速测定,20mg Cu2紫色络合但不太灵敏；不物同蛋白质显色相2 / 4 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 个人收集整理 仅供参考学习似紫外吸取法较为灵敏,50-快速, 5-10min 蛋白质中地酪氨用于层析柱流出100ug 酸和色氨酸残基液地检测；核酸在 280nm处地地吸取可以校正光吸取考马斯亮蓝法灵敏度最高,1-快速, 5-10min 考马斯亮蓝燃料最好地方法,干5ug 与 蛋 白 质 结 合扰物质少,颜色时 , max465nm稳固：颜色深浅变为 595nm岁蛋白质不同而变化参考文献：郭颖娜,孙卫. 蛋白质含量测定方法地比较. 河北化工 .2022,314:37 【试验结果记录】1.标准曲线记录1 2 3 4 5 管号0 第一次 OD 其次次 OD 第三次 OD 平均值 OD 2.试验记录OD 平均 OD值浓度物质组别1 豆浆 100* 2 3 1 豆浆 200* 2 3 1 鸡蛋 100* 2 3 1 鸡蛋 150* 2 3 【附录】3 / 4 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 我们预试验地各管号个人收集整理仅供参考学习O.D 值与标准曲线如下：管号0 1 2 3 4 5 第一次0.035 0.056 0.076 0.097 0.112 0.135 其次次0.035 0.057 0.076 0.097 0.112 0.135 第三次0.035 0.056 0.076 0.097 0.113 0.135 平均值0.035 0.056 0.076 0.097 0.112 0.135 待测豆浆与鸡蛋清蛋白质含量：物质OD0.093浓度豆浆 100*1.949616368豆浆 200*0.0581.054475703鸡蛋 100*0.0831.693861893鸡蛋 150*0.0891.8473145784 / 4 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 4 页
