微生物的纯培养和显微技术.pptx

微生物微生物特点特点第1页/共81页第2页/共81页第3页/共81页第4页/共81页培养物（culture）:指在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。纯培养物（pureculture）：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代，称纯培养。所得培养物成为纯培养物。有关概念第5页/共81页第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术二、用固体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法)四、单细胞（孢子）分离五、选择培养分离六、微生物的保藏技术第6页/共81页一、无菌技术(aseptictechnique)指在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术。消毒(disinfection)(disinfection)：指采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌,而对被消毒的物体基本无害的措施。(部分杀灭微生物)灭菌(sterilization)(sterilization)：指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。(彻底杀灭微生物)又可分为：杀菌和溶菌两种。抑菌(bacteriostasis)(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。防腐(antisepsis)(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。无菌(asepsis)(asepsis)：不存在活菌，多是灭菌的结果。第7页/共81页1、微生物培养的常用器具及其灭菌第8页/共81页第9页/共81页火焰灼烧法干热灭菌法烘箱内热空气灭菌法高温灭菌巴氏消毒法常压下煮沸消毒法间歇灭菌法湿热灭菌法常规加压灭菌法加压下连续加压灭菌法第10页/共81页高压蒸汽灭菌锅第11页/共81页2、接种操作接种工具：白金or镍铬合金接种针/环操作环境：超净工作台第12页/共81页第13页/共81页第14页/共81页双管移植法第15页/共81页二、用固体培养基分离纯培养第16页/共81页指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。第17页/共81页第18页/共81页几种菌落第19页/共81页第20页/共81页用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。第21页/共81页第22页/共81页a:用用接种环接种环取一滴或少量取一滴或少量待培养物在待培养物在1处划线，接种处划线，接种环灭环灭菌后菌后,转动平板在转动平板在2处处划线划线,再对接种环灭菌后在再对接种环灭菌后在3处处划线。划线。b:对平板培养后各处的菌落情况。对平板培养后各处的菌落情况。第23页/共81页第24页/共81页第25页/共81页第26页/共81页2、倾注平板法（pour plate）先将待分离的材料用无菌水做一系列的稀释(如110、1100、11000、110000等等)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。又称稀释倒平板法(对一些热敏感菌和严格好氧菌不利)第27页/共81页3、涂布平板法（spread plate）先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。第28页/共81页倾注平板法涂布平板法第29页/共81页第30页/共81页先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。稀释摇管法-稀释倒平板法的一种变通形式第31页/共81页第32页/共81页三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法)第33页/共81页四、单细胞（孢子）分离 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞分离法。这种方法对操作技术要求较高，多限于高度专业化的科学研究中使用。第34页/共81页 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。第35页/共81页第36页/共81页五、选择培养分离第37页/共81页第38页/共81页第39页/共81页第40页/共81页六、微生物的保藏技术第41页/共81页第42页/共81页第43页/共81页第44页/共81页第45页/共81页第46页/共81页第47页/共81页菌种保藏方法连续移接改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。第48页/共81页1、传代培养保藏是微生物保存的基本方法。琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存。4保存。第49页/共81页2、冷冻保藏代谢作用停止。细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5%左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。第50页/共81页3、干燥保藏法沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。第51页/共81页沙土管保存一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。第52页/共81页冷冻真空干燥保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。第53页/共81页第54页/共81页第55页/共81页第二节显微镜和显微技术一、显微镜的种类及其原理二、显微观察样品的制备三、显微镜下的微生物第56页/共81页分辨率:指能辨别两点之间最小距离的能力。反差:指样品区别于背景的程度。第57页/共81页波长与分辨率分辨率(最小可分辨距离)=0.5nsin=2NA第58页/共81页一、显微镜的种类及原理1.普通光学显微镜(复式显微镜)机械装置:镜座、支架、载物台、调焦螺旋等光学系统:物镜、目镜、聚光镜等使用油镜时加镜油的目的:(1)增加照明亮度(2)增加显微镜的分辨率第59页/共81页光学显微镜第60页/共81页2.暗视野显微镜主要用于观察生活细菌的运动性。第61页/共81页3.相差显微镜通过环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差(明暗差)，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。第62页/共81页4.荧光显微镜在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体。第63页/共81页第64页/共81页5.透射电子显微镜(TEM)6.扫描电子显微镜(SEM)7.扫描隧道显微镜(STM)第65页/共81页二、显微观察样品的制备1、光学显微镜的制样(1)活体观察压滴法将菌悬液滴于载玻片上,加盖盖玻片后立即进行显微镜观察。悬滴法在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹载玻片上后进行显微镜观察。菌丝埋片法将无菌小块玻璃纸铺于平板表面,涂布放线菌或霉菌孢子悬液,经培养取下玻璃纸置于载玻片上,用显微镜对菌丝的形态进行观察。特点:可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏,并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性及生长过程中的形态变化。第66页/共81页(2)染色观察染色前固定样品的目的:杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化学固定两种方法。第67页/共81页第68页/共81页第69页/共81页第70页/共81页第三节显微镜下的微生物第71页/共81页不同光镜照片(用四种不同技术制得的纤毛虫)a:明视野显微镜;b:暗视野显微镜;c:相差显微镜;d:Nomarski显微镜微分干涉相衬显微镜第72页/共81页光镜照片(啤酒酵母属面包酵母细胞)a:明视野显微镜b:相差显微镜c:暗视野显微镜第73页/共81页光镜照片(正在大量繁殖面包酵母细胞)a:明视野显微镜b:暗视野显微镜第74页/共81页光镜照片(纤毛虫的活细胞)a:明视野显微镜(x100);b:暗视野显微镜(x110);c:相差显微镜(x100)第75页/共81页光镜照片(a:两端生鞭毛的大肠杆菌;暗视野显微镜;b:紫色红螺菌;相差显微镜)第76页/共81页电镜照片(淋巴细胞)(a:透射电镜;淋巴细胞薄片二维内部结构;b:扫描电镜;三维表面结构)第77页/共81页电镜与光镜照片(正在进食的纤毛虫)第78页/共81页一、填空1、无菌技术包括_、_无菌和_技术。2、最常用的灭菌方法有_、_和_等。3、纯种分离方法通常用_、_、_、_，其中，要测定食品中细菌的总数时，被测样品加入培养皿时应采用_方法。4、通常采用_和_方法来分离自然界中混杂微生物中只占少数的特定有用微生物，其原理是根据_。5、微生物菌种保藏的原理是在_、_、_、_、_等环境条件下，使其处于代谢不活泼状态。6、_和_是决定显微观察效果的一个重要因素，而_又是决定物镜性能的最重要指标。7、显微技术除了显微镜的特性外，还取决于_、_和_。8、用油镜观察时，需在载玻片与镜头之间加滴_，其作用_和_。第79页/共81页二、是非题1、光学显微镜的分辨率与所用波长所正比。（）2、荧光显微技术原理是在紫外光的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体。（）3、明视野显微镜观察到的微生物是透明的，而暗视野显微镜观察到的微生物是亮的。（）4、透射电镜可以观察样品的表面结构，而扫描电镜可观察样品的内部结构。（）三、名词解释1、Pureculture：2、Colny：3、单孢子分离法：4、灭菌：5、消毒：四、问答题1、要想提高显微镜的分辨率和反差，从显微镜的设计要考虑哪几个主要因素？并举例说明。2、简述平板稀释法测定活菌数的操作过程，并分析该法成败的关键。3、引起菌种退化的根本原因是什么？如何防止菌种退化？第80页/共81页感谢您的观看！第81页/共81页