细菌与酵母表面展示技术.pptx

定义：细菌表面展示技术是利用基因工程手段将某一蛋白或短肽段（靶蛋白）与微生物外膜蛋白（载体蛋白）以融合蛋白的形式呈现在细胞表面。第1页/共20页外源蛋白与载体蛋白结合方式C端融合(N端锚定在外膜)N端融合(C端锚定在外膜)夹心融合(有些蛋白本身具有信号肽序列及锚定于外膜的序列，内部合适位点插 入外源蛋白)第2页/共20页细菌表面展示系统传统：细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位（如菌毛、鞭毛等）近年：冰晶核蛋白、自体运转蛋白、S2层蛋白等每种展示系统都有自身的缺点（如展示蛋白大小的限制、错误定位、形成包涵体、外膜不稳定等），因此需要开发新的系统，以进一步优化表面展示系统。第3页/共20页早期研究多集中在革兰氏阴性菌。原因是遗传背景清楚，便于控制蛋白展示。但是从应用上来看，革兰氏阳性菌的某些特性更适合于表面展示。如下表：第4页/共20页缺点：转化率低，限制构建较大容量缺点：转化率低，限制构建较大容量的肽库；一些革兰氏阳性菌分泌大量的肽库；一些革兰氏阳性菌分泌大量蛋白酶，这会给应用带来麻烦。蛋白酶，这会给应用带来麻烦。表面锚定表面锚定机制机制外源蛋白外源蛋白插入数插入数展示蛋白展示蛋白通过膜层通过膜层细胞壁细胞壁 革兰氏阴革兰氏阴性菌性菌 有有 较短的片较短的片段段质膜层，并与外膜正确结合较薄较薄革兰氏阳革兰氏阳性菌性菌 有有 多达几百多达几百个个只需需通过单个单个质膜层较厚，坚较厚，坚固易操作固易操作第5页/共20页细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪或流式细胞筛选仪，是非常有效的高通量筛选方法。优点：1、能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。2、目前唯一能够定量检验单细胞水平和大量突变体催化活性的方法。3、定量分析酶活性 4、同时检测多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。与噬菌体相比：细菌表面展示技术在疫苗应用上具有独特优势；进行更快速更高效筛选第6页/共20页与传统的生物陶选技术相比，荧光激活细胞筛选仪具有以下特色高富集比高阳性率避免“亲和效应”第7页/共20页基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白细菌表面展示冰核蛋白是丁香假单胞菌的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成，它通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。狂犬病毒糖蛋白是病毒与宿主细胞结合的配体，介导病毒与靶细胞结合。而且是狂犬病毒的主要保护性抗原，能刺激机体产生抗体，保护机体抵抗病毒感染。方法：1 冰核蛋白N末端序列的PCR扩增2 狂犬病毒糖蛋白序列的PCR扩增3 重组表达载体的构建4 重组载体的表达（可以导入大肠埃希菌培养、菌体裂解）5 蛋白表面展示的初步鉴定（结合ELISA，分光光度法鉴定重组蛋白是否成功展示在细胞表面）第8页/共20页综上所述，细菌表面展示系统灵活综上所述，细菌表面展示系统灵活多样，操作简便，在多个领域显示多样，操作简便，在多个领域显示出广泛的应用前景，随着新的载体出广泛的应用前景，随着新的载体系统的发展和其自身的不断完善，系统的发展和其自身的不断完善，细菌表面展示技术必将在实践中发细菌表面展示技术必将在实践中发挥更大的作用。挥更大的作用。第9页/共20页酵母表面展示技术第10页/共20页原理酵母细胞表面展示技 术是近年来发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面。第11页/共20页简介：酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立以后发展起来的展示系统。酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物的细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示具有优越性。酵母细胞颗粒大，可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以-凝集素作为融合骨架。第12页/共20页1.目的蛋白-凝集素表面展示系统 此系统将目的蛋白作为N端，与-凝集素C端部分融合，目的蛋白经-凝集素展示酵母细胞表面。-凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发挥作用。迄今，已有多个应用-凝集素的C端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是-半乳糖苷酶。第13页/共20页 Schreuder等将来自瓜儿豆胶的-半乳糖苷酶的基因插入到酿酒酵母转化酶分泌信号和-凝集素C端部分编码序列之间。-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶-凝集素（-Gal-ACI）融合蛋白，均由固有的磷酸果糖激酶(PGK)启动子控制，并且是多拷贝的。批量培养过程中检测了细胞和生长介质中的酶活性，-半乳糖苷酶被高效分泌入培养介质，而Gal-ACI融合蛋白主要与细胞有关。第14页/共20页2.-凝集素-目的蛋白表面展示系统 这是一种将目的蛋白作为C端与-凝集素Aga2p亚基的N端融合的表面展示系统。-凝集素通过与-凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与-凝集素不同，-凝集素由两个亚单位的糖蛋白组成。酵母表面展示系统应用在酿酒酵母的-凝集素将外源蛋白质展示与细胞表面。-凝集素由核心亚单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成，Agalp 共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母细胞壁共价连接。Aga2p通过两个二硫键与Agalp结合，外源蛋白通过与Aga2p的C端融合可展示在酵母细胞表面。第15页/共20页 天然-凝集素结合活性部位在Aga2p的C端，因此，此处代表了一个细胞外大分子的可及性区域和展示固定蛋白质的有用位点。酵母有两种交配类型MATa和MATa的单倍体细胞，这两种细胞之间的相互交配融合是通过细胞表达-凝集素和-凝集素的相互作用介导的。第16页/共20页目前，酵母表面展示技术被广泛应用于蛋白质分子的相互识别、定向进化以及新型疫苗的研制等发面。蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力和稳定性的定型进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟;活的口服疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体，因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有免疫原型。因而可通过在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的的突变体分离成为可能。由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景。第17页/共20页 前景：表面展示技术日新月异，酵母展示系统在不断的完善和改进，在多个领域得到广泛应用。由于其是真核细胞展示系统，对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展示具有独特的优越性，相信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研究方面发挥越来越重要的作用。第18页/共20页谢谢观赏第19页/共20页感谢您的观看！第20页/共20页