色谱分析法导论.pptx

1现现 代代 仪仪 器器 分分 析析 的四大波谱:光谱法、核磁共振波谱法 、色谱法、质法、光谱法:利用光(电磁辐射)作为“探针”来探测物质性质、含量和结构的光学含量和结构的光学分析法分析法.核磁共振波谱法:利用磁性核在外磁场作用下,核自旋能及跃迁原理来研研究究有有机机物物的结构与组成的一种化学物理分析法.第1页/共194页2质谱法:是是将将待待测测样样品品在在离离子子源源中中转转化化为为离离子子,然然后后利利用用离离子子在在电电磁磁场场中中运运动动的的性性质质,将将离离子子按按质荷比(m/e)(m/e)分开,记记录录并并分分析析离离子子按按质质荷荷比比大大小小排排列列质质谱谱图图,通通过过对对质谱图的的解析进行进行定性,定量分析.色谱法:利利用用样样品品中中各各组组分分在在固固定定相相与与流流动动相相中中受受到到的的作作用用力力不不同同，而而将将待待分分析析样样品品中中的的各各组组分分依依次次分分离离，然然后后顺顺序序检检测测各各组分含量的分离分析方法。组分含量的分离分析方法。第2页/共194页3色谱法是是一一种种分离技术,把把这这种种分分离离技技术术应应用用到到分分析析领领域域.并并与与适适当当的的检检测测手手段结合起来段结合起来,就是就是色谱分析法.由由于于色色谱谱法法的的分分离离效效率率比比常常用用分分离离方法(如如重结晶、蒸馏、萃取等)高高效.又又有有非非常常灵敏的的检检测测手手段段.因因此此应用范围极极其其广泛,已已成成为为生生产产、科科研研等等各各部部门门不不可缺少的分离分析手段可缺少的分离分析手段.第3页/共194页4色谱法也叫层析法层析法，它是一种高效能的物物理化学分离技术理化学分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。9.1 概述第4页/共194页5Michael Tswett(1872-1919),a Russian botanist,discovered the basic principles of column chromatography.He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate.The various pigments separated into colored bands;hence the name chromatography.他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。）。第5页/共194页6 色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。第6页/共194页7此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。第7页/共194页8现现在在的的色色谱谱法法早早已已不局限于于色素的的分分离离，其其方方法法也也早早已已得得到到了了极极大大的的发发展展，但但其其分分离离的的原原理理仍仍然然是是一一样样的。我们仍然叫它色谱分析。的。我们仍然叫它色谱分析。第8页/共194页9一.色谱定义:利用物质(样品)中组分在固定相与流动相中受到作用力不同,而将待测样品分离,然后顺序检测各组分含量的一种物理化学分析方法.第9页/共194页10二 色谱法的发展历史色谱法的发展历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用19061906TswettTswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。19311931Kuhn,LedererKuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离a-a-、b-b-和和g-g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。重视。19381938Izmailov,ShraiberIzmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。最先使用薄层色谱法。19381938Taylor,UrayTaylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。19411941Martin,SyngeMartin,Synge提出色谱塔板理论提出色谱塔板理论；发明液；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。（即气相色谱）。19441944ConsdenConsden等等发明了纸色谱。发明了纸色谱。19491949MaclleanMacllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。19521952Martin,JamesMartin,James从理论和实践方面完善了气从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。液分配色谱法。19561956Van DeemterVan Deemter等等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。19571957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。19581958GolayGolay发明毛细管柱气相色谱。发明毛细管柱气相色谱。19591959Porath,FlodinPorath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。发表凝胶过滤色谱的报告。19641964MooreMoore发明凝胶渗透色谱。发明凝胶渗透色谱。19651965GiddingsGiddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。19751975SmallSmall发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。检测的新型离子色谱法。19811981JorgensonJorgenson等等创立了毛细管电泳法。创立了毛细管电泳法。第10页/共194页11在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J.A.J.P.P.Martin(Martin(马丁)和R.L.M.R.L.M.Synge(Synge(辛格)，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相 （即气相色谱）。19521952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。A.J.P.MARTIN.(1910-2002)of the British National Institute for Medical Research shared with fellow countryman R.L.M Synge the Nobel Prize in Chemistry(1952)for the invention of partition chromatography.R.L.M.Synge born Oct.28,1914,Liverpool,Eng.died Aug.18,1994,Norwich,Norfolk.Synge studied at Winchester College,Cambridge,and received his Ph.D.at Trinity College there in 1941.MARTINSynge第11页/共194页12:由19061906算起,色谱学已有近百年的历史.最初色谱学并未被人所重视.三十年代新的色谱技术分相继产生,如薄层色谱、离子交换色谱.在四十年代由发展了分配色谱、纸色谱以气-固形式的气相色谱.第12页/共194页13五十年代初期气-液分配色谱的出现导致化学实验室技术上的一个史无前例的改革 (其中包括离子交换色谱分析氨基酸和凝胶过滤色谱).).六十年代中期,开始了液相色谱现代化的进程.六十年代末,液相色谱迅速地赶上气相色谱的发展第13页/共194页14 七十年代,气相和液相同步发展.八十年代液相色谱发展远远超过了气相色谱发展.高效液相色谱成为当前最受重视的色谱技术.九十年代出现了毛细管电泳,使色谱分离更完善.第14页/共194页15 色谱学发展过程中的一些重要事件,按时间地顺序排列如下:19031903年 TswettTswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文.19061906年 正式提出色谱法.19381938年 IzmailovIzmailov和ShraiberShraiber第一次使用薄层色谱法.第15页/共194页161941 1941 MartinMartin和SyngeSynge用分配色谱分离氨基酸.1944 1944 MartinMartin和SyngeSynge发展了纸色谱成功分离氨基酸.1952 1952 MartinMartin等人又提出了以气体为流动相的气相色谱.（气-液分配色谱）1956 1956 Van Van DeemterDeemter等发表关于色谱效率的速率理论,并应用到气相色谱中.第16页/共194页171957 1957 制作离子交换色谱氨基酸分析仪.1959 1959 在Gordon Gordon ConferenceConference上提出了第一篇凝胶过滤色谱的报告.1963 1963 GiddingsGiddings的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础.6060年代中期 凝胶渗透色谱出现.6060年代后期 亲合色谱出现.第17页/共194页1819691969年 高效液相色谱法迅速发展,使色谱成为一门应用广泛的分离分析方法.在现代分离分析技术中占有极重要的地位.8080年代 现代液相色谱法迅速发展,很快超过气相色谱、层析色谱.9090年代 出现了毛细管电泳色谱.使色谱分离更加纯度大大提高.第18页/共194页19 三.应用概况 色谱法的应用范围相当广泛,除化学分析外,生物化学、石油化学、有机化学、无机化学、农业、生命、食品、轻工、医药学科中都普遍采用色普技术.在现代所有的分析仪器中,没有一种象色谱仪这样在实际中得到如此迅速合广泛得应用.第19页/共194页20药物分析:人体代谢产物、营养成分、药物浓度、兴奋剂、巴比妥类安眠药.自然界:大气中一氧化碳分析、空气污染程度、苯系物、含硫化合物.水中有机、卤化物、氯仿、四氯化碳、饮用水中有害物质.第20页/共194页21食品工业:食品中农药残留、有机磷、有机氯、茶叶,加入WTOWTO、108108项指标检测.大部分用色谱分析,氰戊菊脂、甲氰菊脂、优乐得.欧盟指标.0.1mg/kg.0.1mg/kg.标准下降100100倍到几十倍1 ug/kg1 ug/kg，现在已增加到276276项。蔬菜、水果、粮食、肉类、营养成分、有效成分、农残.第21页/共194页22肯定列表：是日本针对食品中农业化学品残留管理而制定的一项新制度。目标物：农药，食品添加剂和兽药。2006年5月以前：242农药、30兽药2006年5月以后：750项农药和兽药 检测指标 KBAB沿柱移动距离 LAB浓度第70页/共194页71图中KA KB，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽 显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。第71页/共194页72 若要使若要使A A、B B组分完全分离，必须满足以下三点：组分完全分离，必须满足以下三点：第一第一，两组分的，两组分的分配系数分配系数必须有必须有差异差异；第二第二，区域，区域扩宽扩宽的速率应的速率应小于小于区域区域分离分离的速的速 度；度；第三第三，在保证快速分离的前提下，提供，在保证快速分离的前提下，提供足够长足够长 的色谱的色谱柱柱。第一、二点是完全分离的必要条件。第一、二点是完全分离的必要条件。第72页/共194页734塔板数式中：tRtR为某组分的保留时间；W1/2W1/2为某组分色谱峰的半宽度；W W为色谱峰的峰底宽度。由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关。保留时间越大，峰越窄，理论塔板数就越多。柱效能也就越高。组分在色谱柱中的分配次数，塔板数越大，平衡次数越多，组分与固定相和流动相作用越强，柱效越高.第73页/共194页745 分离度 R 分 离 度 R 是一个综合性指标。它是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定定义义相相邻邻两两组组分分色色谱谱峰峰保保留留值值之之差差与与两两组组分分色色谱谱峰峰底底宽宽总总和和之之半半的比值，即的比值，即 R=2(tr2-tr1)/Y1+Y2 第74页/共194页75 R=(tr2-tr1)/Y Y21/21/2+Y Y11/21/2R R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R1R1时，两峰有部分重叠；当R=1R=1时，分离程度可达98%98%；当R=1.5R=1.5时，分离程度可达99.7%99.7%。第75页/共194页76第76页/共194页779.3 色谱法基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离.组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。第77页/共194页78 但当两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。第78页/共194页79一塔板理论 最早由MartinMartin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。第79页/共194页80 塔板理论是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论半经验式的理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。第80页/共194页81 塔板是从精馏中借用的，但它成功地释了色谱流出曲线呈正态分布。第81页/共194页82(一)塔板理论假定：1 1 塔板之间塔板之间不连续；不连续；2 2 塔板之间塔板之间无分子扩散；无分子扩散；3 3 组组分分在在各各塔塔板板内内两两相相间间的的分分配配瞬瞬间间达达至至平平衡衡，达达一一次次平平衡衡所所需需柱柱长长为为理理论论塔塔板板高高度度H H；第82页/共194页834 某组分在所有塔板上的分配系数相同；5 流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。第83页/共194页84塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔，塔内存在许多塔板.组分在每个塔板的气相和液相间进行分配，达成一次分配平衡。然后随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。第84页/共194页85经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱），分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱柱），从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。第85页/共194页86分离过程如下图所示第86页/共194页87第87页/共194页88下面我们再举一个例子说明组分在色谱柱中的分配情况。为简单起见，设色谱柱由5决塔板（n=5n为柱子的塔板数）组成，并以塔板编号r表示 r=0，1，2，3，4，5；某组分的分配比k=1。第88页/共194页89根据上述假定在色谱分离过程中。该组分的分布可计算如下：开始时，将单位质量（即 m=1）的该组分进入0号塔板上，然后将流动相以一个板体积（V）一个板体积的脉动形式进入色谱柱；此时组分将安下表所示在固定相和流动相进行分配：第89页/共194页90 板号板号r 载气体积载气体积0123进样进样mM0.5mS0.5 VmM0.250.25mS0.250.252 VmM0.1250.125+0.1250.125mS0.1250.125+0.1250.1253 VmM0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063mS0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063第90页/共194页91按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气相和液相的总质量）见下表：第91页/共194页92 r n01234出口出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.032第92页/共194页9360.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2740.2740.11880.0040.0320.0860.1960.2740.13390.0020.0180.0590.1410.2360.138100.0010.0100.0380.1000.1890.118第93页/共194页94 n r01234出口出口1100.0050.0240.0690.1450.0951200.0020.0160.0460.1070.0731300.0010.0080.0300.0760.05414000.0040.0190.0530.03815000.0020.0120.0360.02816000.0010.0080.0240.018第94页/共194页95由表中可见，当n=5时，即5个塔板体积的流动相进入柱中时，组分就开始从柱口流出。并且呈现先小后大的情况。第95页/共194页96以上是当塔板数为5时的情况，出现的峰形不对称，这是由于塔板数太少的原因。所以色谱峰一般为正态分布。当塔板数大于50时，峰形就是对称的。在实际色谱柱中，n值很大（约为106 109）。第96页/共194页97（二）柱效能指标：对于一个色谱柱来说，其分离能力（叫柱效能）的大小主要与塔板的数目有关，塔板数越多，柱效能越高。色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效塔板数来表示。第97页/共194页98式中：t tR R为某组分的保留时间；W W1/21/2为某组分色谱峰的半宽度；W W 为色谱峰的峰底宽度。1 1理论塔板数n n：对于一个柱子下说，其理论塔板数可由下式计算：第98页/共194页99 由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关。保留时间越大，峰越窄，理论塔板数就越多。柱效能也就越高。第99页/共194页100 对对于于一一个个柱柱长长固固定定为为L的的柱柱子子，其其理理论论塔塔板板高度高度H为为 每每一一个个塔塔板板的的高高度度，即即组组分分在在柱柱内内每每一一次次分分配配平平衡衡所所需需要要的的柱柱长长叫叫理理论论塔塔板板高高度度。它它越小越小，也表示，也表示柱效能越高柱效能越高。第100页/共194页1012有效塔板数n有效：在以上计算理论塔板数的式子中使用的是保留时间，它包括了死时间，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。为此，引入了有效塔板数的概念。第101页/共194页102同理有效塔板高度为：3.塔板理论的点：(1)当色谱柱当色谱柱长度一定长度一定时，塔板数时，塔板数 n 越大越大 塔板高度塔板高度 H 越小，越小，被测组分在柱内被被测组分在柱内被分配分配的次数的次数越多越多，柱效柱效 能则能则越高越高，所得，所得色谱峰越窄色谱峰越窄。第102页/共194页103 (2)(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数 K K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)(4)塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第103页/共194页104二二速率理论范弟姆特方程式：塔塔板板理理论论是是一一个个半半经经验验性性的的理理论论。它它定定性性的的给给出出了了板板高高的的概概念念，但但不不能能指指出出影影响响板板高高的的因因素素。速速率率理理论论就就是是在在塔塔板板理理论论的的基基础础上上，给给出出了了影影响响塔塔板板高高度度的因素：的因素：第104页/共194页105 1956年荷兰学者van Deemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。第105页/共194页106该理论模型对气相、液相色谱都适用。van Deemter方程的数学简化式为 第106页/共194页107 u 为流动相线速度；A，B，C为常数，其中 A表示涡流扩散；B分子扩散；C传质阻力（包括液相和固相传质阻力系数）。第107页/共194页108该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。第108页/共194页1091 1）涡流扩散项(A)(A)在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同流出时间不同峰形展宽。展宽程度以A A表示：流动方向第109页/共194页110形象地如图所示。展宽程度以A表示：第110页/共194页111可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。其中 dp填充物平均直径；填充不规则因子。A=2 dp第111页/共194页112第112页/共194页1132 2）分子扩散项(B/u)(B/u)纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进，“塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。第113页/共194页114第114页/共194页115展宽程度以B表示：B=2 D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示；第115页/共194页116q讨论：q分子量大的组分，Dg小，即B小qDg 随柱温升高而增加，随柱压q降低而减小；q 流动相分子量大，Dg 小，即 B q小；q u 增加，组份停留时间短，纵向q扩散小；（B/u）q 对于液相色谱，因Dm 较小，B q项可勿略。球状颗粒；大分子量流动相；适当增加流速；短柱；低温。第116页/共194页1173）传质阻力项）传质阻力项(Cu)因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。第117页/共194页118l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即 CCgCl 第118页/共194页119气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽第119页/共194页120（2）对于液液分配色谱，传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs），即 CCmCs 其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，第120页/共194页121讨论：流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传质阻力Cs。分别与填充物大小 dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关因此，降低固定相传质阻力的方法有。第121页/共194页122因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子 k 和扩散系数Ds等有关。第122页/共194页1234）流速u 由方程 H=A+B/u+Cu知道：当u一定时，仅在A、B、C 较小时，H 较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：第123页/共194页124第124页/共194页125第125页/共194页126板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u第126页/共194页127涡流扩散项A与流速u无关；低流速区(u小)，B/u大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如N2和Ar为载气，可减小扩散，提高柱效；高流速区(u大)，Cu大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如H2和He为载气，可增加扩散系数，提高柱效；第127页/共194页128 H=A+B/u+Cu 对上式求导数，当H最小时，一阶导数为零：dH/du=B/u2+C=0 u最佳=(B/C)1/2 故H最小=A+2（BC）1/2第128页/共194页129曲线的最低点对应最佳线速曲线的最低点对应最佳线速uopt()下的最小板高下的最小板高Hmin()；LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级，即在 LC中，较低流速可获得较大的柱效。第129页/共194页130H=A+B/u+Cu式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。第130页/共194页1315 5 固定相颗粒大小对板高的影响 实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响小。即 在HPLCHPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据！但 颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLCHPLC的分析要求。第131页/共194页132v板高板高,H(cm)第132页/共194页133上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素.但是如何从总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？第133页/共194页1349.4 9.4 分离度及色谱分离方程用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R R。一、分离度(Resolution,R)同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：第134页/共194页135色谱分离中的四种典型情况 分离效果差，柱效低，选择性（）低 完全分离，柱效高，峰窄，选择性（）低 ；完全分离，选择性（）增加，柱效低，峰宽完全分离，柱效高，选择性（）好第135页/共194页136R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R1.5,R1.5,R增加不大)。改变 的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。第141页/共194页142改变组分的改变组分的 值方法：值方法：改改变变固固定定相相,使使各各组组分分的的分分配配系系数数有有较较大大差差别别。例例如如分分离离苯苯和和环环己己烷烷,若若以以邻邻苯苯二二甲甲酸酸二二壬壬酯酯作作固固定定液液,值值为为1.5；而而以以,-氧氧二二丙丙腈腈作作固固定定液液,值值增增加至加至6.3。改改变变柱柱温温。柱柱温温的的改改变变对对不不同同组组分分的的分分配配系系数数的的影响不同。采用较低柱温影响不同。采用较低柱温,一般有利于增大一般有利于增大 值。值。改变流动相的性质和组成。改变流动相的性质和组成。利利用用化化学学衍衍生生法法改改变变组组分分的的性性质质,从从而而改改变变它它们们的分配系数。的分配系数。第142页/共194页1433）分离度R 分配比 k 的关系 k k 增增加加，分分离离度度R R 增增加加，但但当当k10，则则R的增加不明显。通常的增加不明显。通常k在在210之间之间。改改变变 k k 的的方方法法有有：适适当当增增加加柱柱温温(GC)、改改变变流流动动相相性性质质和和组组成成(LC)以以及及固固定定相相含含量量。第143页/共194页144 可可见见,过过大大的的k(10),使使k/(1+k)的的改改变变不不大大,对对R的改进不明显的改进不明显,反而使保留时间大为延长。反而使保留时间大为延长。使使k改变的方法有：改变的方法有：改变柱温（如改变柱温（如GC）改变流动相性质和组成改变流动相性质和组成(在在LC中中)改变相比改变相比k0.51.03.05.08.0103050k/(1+k)0.33 0.50 0.75 0.83 0.89 0.91 0.97 0.98对于一个具体的色谱分离，对于一个具体的色谱分离，k值应该多大？值应该多大？第144页/共194页145结论：结论：值很小的变化值很小的变化,可使有较大的变化。可使有较大的变化。值值趋趋近近于于1时时,它它的的改改变变对对的的增增加加R尤尤为为显显著著；值较大时值较大时,对对R的影响反而减少。的影响反而减少。在在k、N、三三个个参参数数中中,的的增增加加对对分分离离的的改改进进最最有有效效。k从从1增增加加3,R只只增增加加到到原原来来的的1.5倍倍。N增增加加到到原原来来的的3倍倍,而而R只只增增加加到到原原来来的的1.7倍倍。从从1.01增增加加带带1.1,约增加约增加9%,而而Rs却增加到原来的却增加到原来的9倍。倍。第145页/共194页146色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时又使其它待测物的分离不令人满意！GC 实际工作中采用程序升温解决。LC 采用梯度淋洗来解决这个问题。第146页/共194页14770%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂(流动相)组成对色谱分离的影响(梯度淋洗)1 1：9,10-9,10-蒽醌；2 2：2-2-甲基-9,10-9,10-蒽醌；3 3：2-2-乙基-9,10-9,10-蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基-9,10-9,10-蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；改变组成使 k k 最佳第147页/共194页148第148页/共194页1495 基本色谱分离方程式的应用在实际中，基本色谱分离方程式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。第149页/共194页150例9-1有一根 lm长的柱子，分离组分1和2得到如图的色谱图。图中横坐标l为记录笔走纸距离。若欲得到 R=12的分离度，有效塔板数应为多少？色谱往要加到多长？第150页/共194页151解：先求出组分2对组分1的相对保留值r2，1（即值）第151页/共194页152求有效塔板数neffneff 16（0.8）21.1/(1.1-1)21239第152页/共194页153若使R=1.2,所需塔板数可计算,因此,欲使分离度达到1.2,需有效塔板数为2788块,则所需柱长为L=2788/13291m=2.25m第153页/共194页154例9-2 已知某色谱柱的理论塔板数为3600,组分A和B在该柱上的保留时间为27mm和30mm,求两峰的峰半宽和分离度.第154页/共194页155解:w1/2=w/1.7 W1=27/(3600/16)1/2=1.8 mm(w1)1/2 1.8/1.7 1.06 mmW2=30/(3600/16)1/2=2.0 mm(w2)1/22.0/1.71.18 mmR2(30-27)/(1.8+2)6/3.81.6第155页/共194页156例9-3 已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度u和最小塔板高H.解:欲求 u最佳和H最小,要对速率方程微分,即 dH/dud(A+B/u+Cu)/du -B/u2+C0 第156页/共194页157而,最佳线速:u最佳(B/C)1/2 最小板高:H最小A+2(BC)1/2 可得 u最 佳(0.65/0.003)1/214.7cm/s H最 小 0.08+2(0.650.003)1/20.1683cm第157页/共194页158例9-4已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；第158页/共194页159 (2）柱的平均塔板数；n（3）达到1.5分离度所需的柱长度L (4)塔板高度H;(5)在较长柱上把物质B洗脱所需要的时间.第159页/共194页160(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)(2)nA=(16.40/1.11)2=3493nB=16(17.63/1.21)2=3397nav=(3493+3397)/2=3445=3.44103(3)H=L/n=30.0/3445=8.70810-3cm=8.7110-3cm第160页/共194页1614)n2=34452.25/1.124=6.90103源于n1/n2=（R1/R2)2L=nH=6.901038.71103=60.1cm(5)tr2=tr1(R2/R1)2=17.631.52/1.062=35.3分钟第161页/共194页162例：两物质A A和B B在30cm30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.416.4和17.63min17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30 1.30 minmin。物质A A和B B的峰底宽分别为1.111.11和1.21min1.21min。试问：1 1）柱分辨率R R；2 2）柱平均理论塔板数n navav3 3）平均塔板高度H Havav第162页/共194页1634）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？第163页/共194页1641 1）柱分辨率R R；第164页/共194页165 2 2）柱平均理论塔板数n navav第165页/共194页1663）平均塔板高度Hav第166页/共194页167v4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？第167页/共194页1685 5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？第168页/共194页1696 6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R R达到1.51.5，该柱的塔板高度应为多少？第169页/共194页1709.5色谱定性和定量分析 定性分析定性分析利用已知物定性 保留值得 峰增高 双柱法与其它分析仪器结合 色质连用 色谱红外光谱 定量计算方法定量计算方法定量分析的理论依据峰面积的测定方法定量校正因子测定各种定量方法 归一化法 内标法 外标法 内加标准法第170页/共194页171一、色谱的定性分析色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。第171页/共194页172 目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非专属的。第172页/共194页173 因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础