RTqPCR实时荧光定量PCR.pptx

LogoLogo RT-qPCR 原理Contents1 RT-qPCR 步骤2 SYBR 实验步骤3第1页/共15页LogoLogoRT-qPCR 原理原理1定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的方法。1.荧光原理：SYBR Green2.定量原理：（1）介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值 （2）定量原理：绝对定量（标准曲线）、相对定量（2-Ct）（3）融解曲线第2页/共15页非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1 1、SYBR Green SYBR Green 结合于双链结合于双链DNADNA小沟之间，小沟之间，只有和双链只有和双链DNADNA结结合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及延伸过程中发出荧光）延伸过程中发出荧光）RT-qPCR 原理-荧光原理第3页/共15页特异性荧光标记：1、TaqMan 水解型杂交探针。5端标记有报告基团R，3端标记有荧光淬灭基团 Q。探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针R与Q分开，发出荧光。2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号。3、Amplisensor 双链信号引物，进行半巢式扩增；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消失，产物量与荧光成反比。QQR第4页/共15页LogoLogoRT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理1扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（横坐标：扩增循环数（CycleCycle）纵坐标：荧光强度纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的每个循环进行一次荧光信号的收集收集Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。分析定量时多取15-35较好。荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold）：）：前前1515个循环信号作为荧光本底信号（个循环信号作为荧光本底信号（baselinebaseline），即样本的荧光背景值和阴），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。性对照的荧光值。荧光域值荧光域值的缺省设置是的缺省设置是3 31515个循环的荧光信号的标准偏个循环的荧光信号的标准偏差的差的1010倍。倍。第5页/共15页LogoLogoRT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理1理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 log X0=-log(1+Ex)*Ct+log X Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量.1.绝对定量第6页/共15页LogoLogoRT-qPCR 原理原理-绝对定量绝对定量1q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量1.绝对定量第7页/共15页LogoLogoRT-qPCR 原理原理-绝对定量绝对定量1R R2 2为相关系数为相关系数：R R2 20.990.99时，认为时，认为两数值之间相关性好。两数值之间相关性好。E E为扩增效率为扩增效率：一般认为在：一般认为在90%-90%-110%110%之间数据可用。之间数据可用。第8页/共15页LogoLogoRT-qPCR 原理原理-相对定量相对定量12.相对定量病人内参病人内参基因基因病人目的病人目的基因基因对照内参对照内参基因基因对照目的对照目的基因基因Ctabcd结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。第9页/共15页RT-qPCR 原理原理-融解曲线融解曲线温度荧光强度TmTmTm值值：DNADNA解解链链一一半半时的温度时的温度将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)(-dI/dT)融解曲线为单一峰，无非特异性荧光，定量准确。溶解峰反映反应中扩增到的产物的量。前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。第10页/共15页RT-qPCR 步骤步骤-SYBR Green法法1.准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、Realplex软件2.将样本等稍许离心3.加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）反应体系：ddH2O 10L 染料 8L 引物上下游各0.5L 样本 1L4.将八连管标记后离心至无壁挂液体5.将其置入Realplex仪中，设置程序：95 15s 95 15s 57 30s 74 30s 45循环，END后右键设置“insert-melting curve”，后绿色运行6、反应结束后将数据导出，分析数据。第11页/共15页反应体系的建立及优化反应体系的建立及优化:1.1.SYBR Green SYBR Green 使用浓度使用浓度:太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，荧光信号太弱，不酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测易检测2.2.PrimerPrimer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.3.MgClMgCl2 2（多聚酶的激活剂）浓度（多聚酶的激活剂）浓度:可以降低到可以降低到1.5mM,1.5mM,以减少非特异性产以减少非特异性产物物4.4.反应反应BufferBuffer体系的优化体系的优化5.5.反应温度和时间参数反应温度和时间参数:由酶和引物决定由酶和引物决定6.6.其他与常规其他与常规PCRPCR相同相同RT-qPCR 步骤-SYBR Green法第12页/共15页q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点第13页/共15页Thank you第14页/共15页谢谢您的观看！第15页/共15页