taqman法SNP基因分型引物设计及Primerexpressss教程.pptx

内容目录一、SNP引物、探针设计原则二、primer express软件设计教程-以rs2243106为例第1页/共10页扩增产物控制在50-150 bp，以便获得最大扩增效率。探针长度设计在13-25 bp，且位置不与上下游引物重叠。探针Tm值控制在65-67度，GC含量在30-80%。探针5端避免G，以免淬灭荧光基团.两条探针的Tm值相差不要超过1SNP位置应在探针的1/3-2/3处(5-3),必要时，可以移向3端，但不可以放在最后两个碱基的位置上。一、引物设计原则SNP位置SNP位置必要时可以移向3端但不可以在最后两个碱基SNP位置最好在探针1/3-2/3间第2页/共10页primer express软件设计SNP引物教程-以rs2243106为例1SNP序列的获得（1）在NCBI的SNP数据库()中输入SNP号，可以很方便的获得位点信息，但显示的序列较短，无法用于设计引物。即：ACTATTGCTACACTCAGTTTCCCAAC/TTGCTCCTGTATAATCTTGTCTTCTG。如下图所示：第3页/共10页（2）因此，可以通过点击SNP号，进入SNP位点的详细信息页面中(左图)，点击”FASTA”小标签（红圈），获得SNP位点上下游序列信息。注意，SNP位点以兼并碱基的形式给出，即Y代表了C/T。（右图绿色字母）。将其全部复制下来。第4页/共10页2.打开Primer Express软件，点击新建图标，在type中选择taqman MGB Alleic Discrimination,点击OK第5页/共10页3.之后，上图中黑色区域会变为白色活动工作页面；将在NCBI中复制的FASTA格式的序列全部粘贴进去。注意，Y也会被粘贴进去，但是软件不会识别这种复制粘贴进去的Y，需跟随下一个步骤，人工指定。因无法识别Y，该图标为灰色状态；在下一步骤会激活第6页/共10页4.人工指定SNP。选中上图中的Y，将其改为C；再选中改好的C，此时，菜单栏中的图标会亮起，点击图标后，软件会要求使用者根据多态性选择另一个碱基，本例中其多态性为T；点击T后，选中的字母C会再次变回Y。此时，完成了指定SNP位点。第7页/共10页5.完成指定SNP位点后，会变回字母Y（红底），也就是指定SNP位点成功了。此时，就可以点击“绿色播放”按钮，软件就会自动设计上下游引物和探针。第8页/共10页6.软件完成设计后，会生成下图结果报告。在candidate primers&probes中，可以方便的选择引物对，选定之后，可以点击sequence标签，查看所在的位置，或者点击order标签内底部的export，可以方便的输出，以便复制粘贴，用于合成引物。第9页/共10页感谢您的观看！第10页/共10页