菌种选育实用.pptx

第一节第一节 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性v 有些微生物能在厌氧的条件下生长；v 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长；v 有些微生物能进行复杂的代谢；v 有些微生物能利用较复杂的化合物；v 有些微生物能在极端的环境下生长。第1页/共90页二：工业化菌种的要求二：工业化菌种的要求v 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；v 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；v 遗传性能要相对稳定；v 不易感染它种微生物或噬菌体；v 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；v 生产特性要符合工艺要求。第2页/共90页放线菌（链霉素、四环素、红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节第二节 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍第3页/共90页二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：第4页/共90页HD:HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制 HT:HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶第5页/共90页氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单。谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌。常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。第6页/共90页三、食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌第7页/共90页四、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌、沙门氏菌u生长迅速、蛋白产量高;u表达蛋白的纯化、分离及分析快速；u外源基因的导入相对容易；u已建立了整套表达理论及技术.第8页/共90页(二)真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)u 生长迅速，营养要求不高，易培养；u安全性好；u比哺乳动物细胞操作简单；u具有一定的修饰蛋白的能力。第9页/共90页中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统u 具有准确的转录后修饰功能；u 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；u 具有重组基因的高效扩增和表达能力；u 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；u CHO很少分泌自身的内源蛋白。第10页/共90页微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来礼来(Eli lilly),(Eli lilly),花了花了1010年的时间从年的时间从4040万株微万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第11页/共90页u根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏 部门索取或购买；u从大自然中分离筛选新的微生物菌种。第三节 菌种的来源一、菌种的来源第12页/共90页二、分离思路 u新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。u实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。u有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。第13页/共90页u定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。u采样：采样：有针对性地采集样品。u增增殖殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。u分离：分离：利用分离技术得到纯种。u发酵性能测定发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤第14页/共90页菌种筛选主要步骤：菌种筛选主要步骤：调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案 确定采集样品的生态环境 采样 确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离分离 第15页/共90页 原种斜面 确定发酵培养基础条件 筛选 初筛（1株1瓶）复筛（1株35瓶）结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株35瓶）35株 单株纯种分离分离 生产性能试验 毒性试验 菌种鉴定第16页/共90页（一）采样1、采样对象 以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。u一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如 一些野果生长区和果园内。u采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。第17页/共90页从自然界筛选从自然界筛选第18页/共90页 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。第19页/共90页（二）增殖（富集）培养（二）增殖（富集）培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制富集培养。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。第20页/共90页富集的三种方案：u 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。目的微生物富集的一些基本方法目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。u 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，u 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法第21页/共90页定向培养的方法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等.如放线菌材料预处理。但主要是通过培养的方法。第22页/共90页定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。第23页/共90页实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落。从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型第24页/共90页例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72-Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落第25页/共90页目的微生物富集方法的研究进展 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等。目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。2002,陈文新（科学院院士）第26页/共90页（三）培养分离（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。第27页/共90页1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法99ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释第28页/共90页1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法第29页/共90页2.平皿划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法 第30页/共90页菌落的选出菌落的选出从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基；利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素。从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。第31页/共90页在要求获得高产菌株的同时，还应考虑推广到生产过程时的经济问题，在筛选所需菌株时宜考虑的一些重要指标：1.菌的营养特征；2.菌的生长温度应选择温度高于40度的菌种；3.菌对所采用的设备和生产过程的适应性；4.菌的稳定性；5.菌的产物得率和产物在培养液中的浓度；6.容易从培养液中回收产物。第32页/共90页（四）筛 选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。第33页/共90页（五）毒性试验（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第34页/共90页目的微生物培养分离目的微生物培养分离u从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。u到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。u在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。u因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。第35页/共90页1、成功的分离培养方法(1)认真考查所需产品的特征和生产过程；(2)制订初步的筛选标准；(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。第36页/共90页2、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点1罗列出所要分离的微生物类群；2根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：3将若干样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；4罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；第37页/共90页 5列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；7用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。第38页/共90页 (一一)采样和采集方采样和采集方法法 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。细菌的分离第39页/共90页采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及 采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群 的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但 贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生 变化，微生物群体之间就会出现消长。第40页/共90页(二二)生态学参数及培养基的组成原则生态学参数及培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50gm1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。第41页/共90页二、二、分离分离 目的微生物不纯，需分离分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：u纸片培养显色法纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。u透明圈法透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。u变色圈法变色圈法：直接用显色剂或指示剂。u生长圈法生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。u抑制圈法抑制圈法：琼脂块培养法。第42页/共90页用刚果红染色法鉴定筛选降用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株解纤维素的菌株 羧甲基纤维素钠作培养物羧甲基纤维素钠作培养物抗生素筛选抗生素筛选检定菌培养，加上发酵液检定菌培养，加上发酵液第43页/共90页放线菌的分离培养基的组成原放线菌的分离培养基的组成原则则u大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。u在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。u选择性地添加抗生素。u分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37培养箱中存放3天。放线菌的分离放线菌的分离第44页/共90页u土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。u植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。u水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。放线菌的分离放线菌的分离第45页/共90页次代培养及纯化次代培养及纯化u菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。u通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。u成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。u将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。第46页/共90页放线菌菌落形态放线菌菌落形态第47页/共90页真菌分离真菌分离1、利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁徙生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。第48页/共90页4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。第49页/共90页真菌的分离方法真菌的分离方法u土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。u植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。u水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。u子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。第50页/共90页第四节第四节 菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造目的:u 提高生产能力提高生产能力u 提高产品质量提高产品质量u 开发新产品开发新产品u 解决生产实际问题解决生产实际问题u 防止菌种退化防止菌种退化第51页/共90页方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等.第52页/共90页自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况：自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。一、自然选育一、自然选育第53页/共90页自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？第54页/共90页自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落 (注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验第55页/共90页二、诱变育种二、诱变育种 用用各各种种物物理理、化化学学的的因因素素人人工工诱诱发发基基因因突突变变进进行行的的筛筛选，称为诱变育种选，称为诱变育种.诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂.诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍第56页/共90页（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题u 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性u诱变剂量的选择诱变剂量的选择u诱变剂的选择诱变剂的选择u出发菌株的选择出发菌株的选择（一）诱变剂的作用原理（略）（一）诱变剂的作用原理（略）压硝酸：压硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亚硝基胍：亚硝基胍：1MNaOH1MNaOH第57页/共90页（三）诱变育种的一般步骤（三）诱变育种的一般步骤(p38)原始菌种原始菌种纯化化斜面斜面/肉肉汤培养培养单孢子子/单细胞胞悬液液诱变剂处理理平板分离平板分离移至斜面移至斜面小小试中中试初初筛复复筛计算存活率算存活率观察形察形态变异，异，挑挑单菌落菌落良种保藏良种保藏原菌种特性原菌种特性鉴定定第58页/共90页1.出发菌株的选择：出发菌株用来育种处理的起始菌株.出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力；出发菌株的来源；自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株：诱变育种工作中几个应注意的问题第59页/共90页诱变处理方式：理方式：u单一因子一因子处理：理：u复合因子复合因子处理：理：u两种以上因素两种以上因素先后使用先后使用 同同时使用使用 单一因子重复使用一因子重复使用2.复合诱变因素的应用第60页/共90页剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70-80%）3.剂量选择第61页/共90页4.变异菌株筛选(1)平皿快速检测法平皿快速检测法l变色圈法变色圈法l透明圈法透明圈法l生长圈法生长圈法l抑菌圈法抑菌圈法l梯度平板法梯度平板法(2)摇瓶培养法摇瓶培养法第62页/共90页以温度敏感突变为例：以温度敏感突变为例：筛选方法：筛选方法：用途：用途：常用于提高代谢物产量常用于提高代谢物产量原原因因：是是由由于于某某一一酶酶蛋蛋白白结结构构改变后，在高温下活力丧失改变后，在高温下活力丧失重重要要性性：如如果果此此酶酶为为蛋蛋白白质质、核核酸酸合合成成途途径径中中所所需需的的酶酶，则则此此变变异异株株在在高高温温下下的的表表型型就就是是营养缺陷型。营养缺陷型。条件抗性突变型的筛选第63页/共90页举例：举例：u由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理，经诱变处理得到温度敏感变异株得到温度敏感变异株Ts88:u30培养时能正常生长培养时能正常生长;u40是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。u在富含生物素的培养基中进行发酵时：在富含生物素的培养基中进行发酵时：u先在先在30（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（适当时间后提高温度（40，非允许条件），即能获，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。得谷氨酸的过量生产。第64页/共90页方法：梯度平板法（方法：梯度平板法（gradient plategradient plate）抗药性突变株的筛选抗药性突变株的应用：抗药性突变株的应用：u作作为菌株的菌株的遗传标记u作作为生生产菌种（菌种（结构构类似物抗性似物抗性变异株）异株）第65页/共90页产量变异株的异株的筛选：第66页/共90页营养缺陷型营养缺陷型auxo诱变筛选步骤及方法诱变筛选步骤及方法auxoauxo的鉴定的鉴定 诱变处理理auxo的的浓缩auxo的的检出出营养缺陷型营养缺陷型(auxotroph)的筛选的筛选第67页/共90页缺陷型型的浓缩：抗生素法抗生素法原理：原理：青青霉霉素素、制制霉霉菌菌素素等等抗抗生生素素作作用用于于生生长着着的的微微生生物物细胞胞，对休休止止态细胞无作用。胞无作用。方法：方法：将将菌菌培培养养在在含含抗抗生生素的素的MM基中基中。第68页/共90页菌菌丝过滤法法u适用于：适用于：丝状（放状（放线菌、霉菌、霉菌）菌）u原理：基本培养基上只有原理：基本培养基上只有发育成菌育成菌丝；auxo孢子可通子可通过滤膜，野生型菌膜，野生型菌丝不能通不能通过。第69页/共90页逐个检出法：缺陷型型的检出：第70页/共90页 影印平板培养法影印平板培养法第71页/共90页夹层培养法第72页/共90页生长谱法方法简便；回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片 缺陷型缺陷型的鉴定的鉴定：测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；第73页/共90页组合合营养物法：养物法：步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a.将多种将多种营养因子养因子编组；b.将将组合液的合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；片放在涂菌的基本培养基上培养；c.结果分析；果分析；如：一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 1313 14 五组：5 9 12 14 15营养因子分养因子分组编排排时注意注意：1）每）每组内无重复的内无重复的营 养因子养因子 2）每）每组中中应包含只出包含只出 现一次的因子一次的因子 3）每）每组中其他因子中其他因子应 分分别出出现二次二次第74页/共90页 一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 1313 14 五组：5 9 12 14 15第75页/共90页组合补充培养基法：组合补充培养基法：将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷缺陷类型，或快速分离出所需类型，或快速分离出所需缺陷缺陷类型的菌株。类型的菌株。ABFEDCHG第76页/共90页三、抗噬菌体菌株的选育1、噬菌体的分布：、噬菌体的分布：噬菌体广泛分布在自然界，存在于土壤、肥料、粪便和污水中。u从外科病房病人疮口脓液中容易找到金黄色葡萄球菌噬菌体，u从受细菌病害的植株上亦可分离到噬菌体。u在工厂生产中，对排出的菌体如不及时处理，便有可能在下水道 的污水和四周土壤中滋生噬菌体，u在情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体。u总之，凡是有寄主细胞的地方，一般容易找到它们的噬菌体。第77页/共90页2.抗噬菌体菌株的选育u在工业微生物发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。u在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。u由于噬菌体很易发生变异，因此又会出现新的噬菌体，对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。u所以既要不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常进行。第78页/共90页（1）抗噬菌体菌株选育的几种方法 a自然突变以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株，这种方法获得的抗性突变频率很低。b诱发突变敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上。经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与正常菌落的生长速度相近，诱变可以提高抗牲菌株的频率 除上述方法外，还可将敏感菌孢子经诱变后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。第79页/共90页（2）抗噬菌体菌株的特性试验）抗噬菌体菌株的特性试验1）抗噬菌体性状的稳定性试验 将抗性菌袜分别在孢子培养、种于培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。此外，还可以观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。2）抗性菌株的产量试验 考察它对碳源、氮源、通气量、无机磷的添加量及其他培养条件的要求等。例如：采用上述方法获得的林可霉素产生菌的抗噬菌体菌株比原敏感菌株的生产能力有所提高。无论从自然突变或诱发突变所得到的抗噬菌体菌株，在用于无论从自然突变或诱发突变所得到的抗噬菌体菌株，在用于生产之前，均需经过反复验证才能使用。生产之前，均需经过反复验证才能使用。第80页/共90页方法：在合适的培养基中培养待测菌样在对数期进行紫外线照射，诱导原噬菌体复制进一步培养过滤培养物，去处活菌体滤液与指示菌混合、倒平板（或将滤液加到敏感性指示菌的液体培养物中）观察是否有噬菌斑出现（或使菌液变清）.3 3）真正抗性与溶源性的区别试验）真正抗性与溶源性的区别试验第81页/共90页3.噬菌体的防治 不同发酵类型遭到不同种类噬菌体侵染所出现的现象是不同的，不同发酵类型遭到不同种类噬菌体侵染所出现的现象是不同的，而同一菌种被相同的噬菌体侵染，由于侵染的时间不同，也会造成而同一菌种被相同的噬菌体侵染，由于侵染的时间不同，也会造成不同的后果。但都会出现畸形菌丝，菌体迅速消失，不同的后果。但都会出现畸形菌丝，菌体迅速消失，PHPH值上升，值上升，发酵产物停止积累，甚至下降等现象。发酵产物停止积累，甚至下降等现象。第82页/共90页u在发生噬菌体感染时发酵罐排出的废气夹带有大量噬菌体，造成严重污染和扩散。必须在排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散。u此外，在车间内外亦要定期喷洒药物。常用的药物有漂白粉、甲醛、石灰水等。u种子室应尽量设法与外界减少接触，严桔执行无菌操作，并检查空气中有无噬菌体存在。u在噬菌体感染期间，车间内亦要定时检查噬菌体的分布情况，来取有效措随直至消灭为止。噬菌体防治的几个方面：噬菌体防治的几个方面：1、正确判断；2、普及有关噬菌体的知识；3、选育抗噬菌体菌株；4、消灭噬菌体；5、收集和保存噬菌体。第83页/共90页四、工程菌的稳定性问题四、工程菌的稳定性问题 工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性,因而工程菌稳定性的解决已日益受到重视,并成为基因工程这一高技术成就转变为生产力的关键之一.第84页/共90页1.工程菌不稳定性的表现u 表达产物不稳定u质粒的丢失u重组质粒发生DNA片段脱落 由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率往往小于不含重组质粒的比生长速率，即宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。有时质粒不稳定并非由于质粒丢失的缘故，而是重组质粒上一部分片段脱落，表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。第85页/共90页2.解决工程菌不稳定性的对策u组建合适载体：组建合适载体：在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。u选择适当宿主；选择适当宿主；重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响，在选择宿主时，必须确定其遗传特点。相对而言重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。第86页/共90页u施加选择压力：1)抗生素添加法：通常在重组质粒上含有抗药性基因。将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后克隆菌也获得了抗药性。在克隆菌发酵时，在培养基中加入适量的相应抗生素，可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。2)抗生素依赖变异法：通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖性突变株，只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长，因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的目的。3)营养缺陷型法 其原理是通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入到重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。第87页/共90页u控制基因过量表达；u控制培养条件；u在质粒构建时,插入一段能改良宿主细胞生长速率的特殊的DNA片段；u可转移性因子会促进插入和丢失的出现,因此所使用的质粒不应带有可转移因子；u尽可能将质粒上的不需要的DNA部分除去；u固定化重组菌以提高基因工程菌的不稳定性。第88页/共90页本章小节：本章小节：u 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力；u 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；u 目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；u 工程菌的稳定性问题第89页/共90页感谢您的观看。第90页/共90页