王镜岩生化核酸.pptx

第一节第一节核酸的化学组成核酸的化学组成核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基第1页/共76页P330表5-1两类核酸的基本化学组成RNA：D-核糖，A、G、C、U碱基DNA：D-2-脱氧核糖，A、G、C、T碱基第2页/共76页一、碱基1.嘌呤碱：腺嘌呤A鸟嘌呤G2.嘧啶碱：胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TP331结构式3.修饰碱基：100余种，多数是甲基化的产物植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。第3页/共76页二、核苷与脱氧核苷核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型嘧啶碱：C1N1，嘌呤碱：C1N9。P332结构式腺嘌呤核苷胞嘧啶脱氧核苷第4页/共76页三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化P332结构式：5-AMP3-dCMP第5页/共76页第6页/共76页1、构成DNA、RNA的核苷酸P481表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：AMP、GMP、CMP、UMP2、细胞内游离核苷酸及其衍生物第7页/共76页核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。环核苷酸3,5-cAMP，3,5-cGMP激素的第二信使，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpppppGppppApp核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。第8页/共76页第二节第二节DNA的结构的结构一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。第9页/共76页一、DNA的一级结构dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3、5-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。P483图13-2写 法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3第10页/共76页第11页/共76页二、DNA的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNANa盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。Chargaff规律1950年a.所有DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T。P486。b.DNA的碱基组成具有种的特异性。c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。Franklin相 对 湿 度 92%：BDNA。相 对 湿 度 75%：ADNA。ZDNA。第12页/共76页1、Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA)P486图135两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。两条核苷酸链，依靠碱基间形成的氢链结合在一起。A=T、G=C每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距离0.34nm，螺距：3.4nm，双螺旋平均直径2nm，大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nmP487图13-613-7第13页/共76页第14页/共76页2、稳定双螺旋结构的因素碱基堆积力（主要因素）形成疏水环境。碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。第15页/共76页三、DNA二级结构的多型性P489表13-6A-、B-、Z-DNA的比较1、BDNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA右手双股螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺旋扭角36螺距：3.32nm碱基倾角：1生物体内DNA均为BDNA。第16页/共76页2、A-DNA在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。3、Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。第17页/共76页4、DNA三股螺旋（H-DNA）DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。第18页/共76页四、四、DNA二级结构的不均一性二级结构的不均一性1、反向重复序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。较长的回文结构，可形成茎环结构和发夹结构。转录的终止作用与回文结构有关。较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。2、富含AT的序列很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。第19页/共76页五、环状DNA某些病毒DNA某些噬菌体DNA某些细菌染色体DNA细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA第20页/共76页1、环状DNA的不同构象P491图13-12松驰环、解链环、负超螺旋第21页/共76页（1）、松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、正超螺旋与负超螺旋DNA正超螺旋：在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。负超螺旋：在绳子一端向松弛方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。第22页/共76页2、环形DNA的拓扑学特性以 260bp组 成 的 线 形 B-DNA为 例，螺 旋 周 数260/10.4=25。连环数（L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。松驰环：L=25解链环：L=23超螺旋：L=23第23页/共76页缠绕数（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示松驰环T=25解链环T=23超螺旋T=25超螺旋周数（扭曲数W）松驰环W=0解链环W=0超螺旋W=-2L=T+W第24页/共76页比连环差（）表示DNA的超螺旋程度=（LL0）/L0L0是指松驰环形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等第25页/共76页Superhelixdensity=/=每一圈初级螺旋（10bp，360）出现超螺旋数不同生物的DNA分子的大小不同形成几乎相同的超螺旋密度SV405226bpT=522W=-26(L=496)=-0.05E.coli4.2X106bpT=4.2X105W=4.2X105X-0.05=-2X104一般天然DNA分子中=-0.05=5%负向超螺旋第26页/共76页3、拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值。拓扑异构酶酶I（拧紧）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。拓扑异构酶酶II（拧松）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。第27页/共76页六、DNA的生物学功能首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。P34214Avery的肺炎双球菌转化实验第28页/共76页第29页/共76页第三节第三节RNA的结构的结构一、RNA的一级结构AMP、GMP、CMP、UMP通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。P484图13-3RNA基本结构第30页/共76页组成RNA的戊糖是核糖RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。第31页/共76页二、RNA的类型核糖体RNA：rRNA转运RNA：tRNA信使RNA：mRNA核内小RNA：snRNA（smallnuclearRNA）P344表5-7大肠杆菌中的RNA第32页/共76页三、tRNA的结构70-90b，分子量在25kd左右，沉降系数4S左右有较多稀有碱基图3末端为CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。5末端大多为pG或pC二级结构是三叶草形P496图46-18tRNA的二级结构（三叶草模型）第33页/共76页第34页/共76页四、mRNA的结构1、真核mRNA的结构（1）、3-端有一段约30-300核苷酸的polyA。PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。polyA与 mRNA半 寿 期 有 关，新 合 成 的 mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。（2）、5-帽子P346帽子结构：第35页/共76页帽子结构：3-mG-5ppp5-Nm-3-P5末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5-5-磷酸二酯键。帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。第36页/共76页2、原核mRNA的结构（多顺反子）由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5帽子和3polyA。SD序列：5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。SD序列和核糖体16S的rRNA的3末端富含嘧啶碱基的序列互补。第37页/共76页六、rRNA的结构rRNA与核糖体蛋白结合一起构成核糖体。大肠杆菌中有三类rRNA：5SrRNA，16SrRNA，23SrRNA真核细胞有四类rRNA：5SrRNA，5.8SrRNA，8SrRNA28SrRNAP346图5-14大肠杆菌5SrRNA结构第38页/共76页第39页/共76页第四节第四节核酸的性质核酸的性质第40页/共76页一、解离性质磷酸和碱基能发生两性解离。DNA等电点44.5RNA等电点22.5第41页/共76页二、水解性质1、碱水解室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。图在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义：DNA稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。第42页/共76页2、酶水解RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外切酶核酸内切酶：限制性核酸内切酶第43页/共76页三、光吸收性碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收，max=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。第44页/共76页2、含量计算1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL核苷酸3、增色效应与减色效应P347图5-15DNA的紫外吸收光谱增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。第45页/共76页第46页/共76页四、沉降特性（DNA）不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。P348图516Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA相对沉降常数线型双螺旋分子1.00松驰双链闭环1.14切刻双链环1.14单链环1.14线型单链1.30正超或负超螺旋双链环状1.41坍缩3.0第47页/共76页五、变性、复性1、变性核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。P350图5-18变性过程因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。第48页/共76页第49页/共76页（1）、熔解温度（Tm）：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在7085之间。第50页/共76页（2）、影响DNA的Tm值的因素DNA均一性。均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44P351图5-19图5-20Tm值与GC含量的关系介质中离子强度其它条件不变，离子强度高，Tm高。P351图5-21第51页/共76页第52页/共76页2、复性变性DNA在适当（一般低于Tm2025）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量。Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。第53页/共76页P352图5-22，不同DNA的复性时间。1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则50%复性时，Cot1/2=410-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒E.coli4.2106碱基对，若浓度Co=1.0umol/L，则复性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，约115天。复性100%，Cot=500mol.s/L，t=5108秒，5758天。复性机制：10-20bp成拉链第54页/共76页第55页/共76页第五节第五节核酸研究技术核酸研究技术一、核酸的分离纯化尽可能保持其天然状态。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。第56页/共76页1、DNA分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/LNacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。第57页/共76页2、RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。去蛋白：盐酸胍、苯酚等必须防止RNA酶对RNA的破坏。第58页/共76页二、核酸的凝胶电泳1、琼脂糖电泳核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比凝胶浓度DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。电流，不大于5V/cm2、PAGE电泳第59页/共76页三、限制性核酸内切酶（1979年发现）1、限制修饰系统图第60页/共76页2、II型核酸内切酶限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。II型酶的切割频率识别位点444=256646=4096848=65536限制酶的命名：E.coRI第一位：属名E（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位：菌株R第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号第61页/共76页第62页/共76页同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。BamHI：GGATCCBstIGGATCCMboIGATCSau3AGATC同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。BclITGATCABglIIAGATCA星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。例如HindIIIAAGCTT第63页/共76页四、DNA物理图谱及构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。末端标记法构建DNA物理图谱：（1）单酶完全降解和部分降解（2）双酶降解图第64页/共76页五、分子杂交1、SouthernBlottingP353图5-23DNA样品酶切电泳变性转膜固定杂交洗涤放射自显影变性（NaOH0.5mol/L）转膜（NC膜）固定（80，4-6h）杂交（高盐浓度，68，几小时）SouthernBlotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。可用DNA或RNA探针。第65页/共76页第66页/共76页2、NorthernBlotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、WesternBlotting是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。抗原与抗体的杂交第67页/共76页六、DNA序列分析（一）（一）化学裂解法（化学裂解法（Maxam-Gilbert法）法）原理：利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。第68页/共76页32P-GCTACGTA特异性化学裂解在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG第69页/共76页硫酸二甲酯特异切割：G甲酸特异切割：G和A肼在Nacl条件下切割：C肼在无Nacl条件下切割：T和C32P*ACTTCGACAA硫酸二甲酯：*ACTTC甲酸：*P*ACTTC*ACTTCG*ACTTCGAC*ACTTCGACA肼（有Nacl）：*A*ACTT*ACTTCGA 肼（无Nacl）：*A*AC*ACT*ACTT*ACTTCGA从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。第70页/共76页（二）（二）双脱氧终止法双脱氧终止法英国Sanger1955确定牛胰岛素结构，1958获诺贝尔化学奖1980设计出DNA测序法，1980获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。第71页/共76页（三）（三）序列分析仪序列分析仪四色荧光基团标记的ddNTP第72页/共76页七、DNA合成（探针、引物、基因）1、化学合成：固相合成法（亚磷酸三酯法）P353合成过程合成方向：35端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护保护：5-OH、活化3-OH、保护所有NH2第73页/共76页第74页/共76页2、DNA的酶合成PCR模板DNA（单链）引物DNA聚合酶dATP、dGTP、dCTP、dTTP一定浓度的Mg2+合成方向：53端化学合成：方向35，不需DNA模板，酶。生物合成：方向53，需模板，引物，DNA聚合酶。第75页/共76页感谢您的观看！第76页/共76页