微生物的实验室培养—Alan学习教案.pptx

会计学1微生物的实验室培养微生物的实验室培养(piyng)Alan第一页，共52页。几种菌落(jnlu)及其形态第2页/共52页第二页，共52页。几种(j zhn)菌落及其形态第3页/共52页第三页，共52页。专题2:微生物的培养(piyng)与应用第4页/共52页第四页，共52页。培养微生物需要解决的两个问题(wnt)是什么？1、为其提供合适的营养(yngyng)条件和环境条件2、防止杂菌的入侵思考(sko):第5页/共52页第五页，共52页。一、培养基1.1.营养成分：营养成分：思考(sko)：微生物“吃”什么？水、无机盐、碳源、氮源水、无机盐、碳源、氮源此外，还需要满足(mnz)微生物生长对pH、特殊营养物质（如:生长因子)以及氧气等的要求。第6页/共52页第六页，共52页。一、培养基：一、培养基：一、培养基：一、培养基：1.1.基本成分：基本成分：碳源无机(wj)碳源：有机(yuj)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉(ni ru)膏自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源无机氮源：有机氮源：N2、NH4、NO3-蛋白胨第7页/共52页第七页，共52页。牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用是一种应用(yngyng)(yngyng)最广泛和最普通的细菌基础培养最广泛和最普通的细菌基础培养基。基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g琼脂20.0g分析其营养分析其营养(yngyng)(yngyng)构成？构成？第8页/共52页第八页，共52页。C第9页/共52页第九页，共52页。.自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别(chbi)是()A碳源 B氮源 C无机盐 D特殊营养物质A第10页/共52页第十页，共52页。n n.概念概念(ginin)(ginin)：n n.种类：种类：一、培养基人们按照微生物对营养物质的不同人们按照微生物对营养物质的不同(b tn)(b tn)需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。（1）按物理性质来分：固体(gt)培养基和液体培养基（2）按功能来分：选择培养基和鉴别培养基第11页/共52页第十一页，共52页。固体(gt)培养基：菌落backback第12页/共52页第十二页，共52页。选择选择(xunz)培养基培养基n n加入加入(jir)(jir)青霉素的培养基青霉素的培养基n n加入加入(jir)(jir)高浓度食盐的培养基高浓度食盐的培养基 n n不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基n n不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基分离(fnl)酵母菌、霉菌等真菌（抑制细菌、放线菌的生长）分离金黄色葡萄球菌分离固氮菌分离自养型微生物babackck第13页/共52页第十三页，共52页。伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢(dixi)产物与伊红美蓝结合，使菌落呈黑色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。例如：鉴别(jinbi)大肠杆菌培养基大肠杆菌(d chn n jn)呈黑色中心,有或无金属光泽bacback k第14页/共52页第十四页，共52页。n n获得纯净获得纯净(chnjng)(chnjng)培养物的关键是什么？培养物的关键是什么？二、无菌技术(jsh)防止(fngzh)外来杂菌污染1.目的：2.方法：消毒与灭菌消毒与灭菌的概念和区别？第15页/共52页第十五页，共52页。第16页/共52页第十六页，共52页。2.2.无菌范围无菌范围(fnwi)(fnwi)：实验实验(shyn)(shyn)操作空间消毒操作空间消毒操作者的手、衣着操作者的手、衣着(yzhu)(yzhu)消消毒毒实验用具灭菌实验操作过程二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：酒精灯旁操作超净工作超净工作台台第17页/共52页第十七页，共52页。有些细菌在一定有些细菌在一定的条件下，细胞里面的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢眠体，叫做芽孢(y(y bo)bo)。芽孢。芽孢(y bo)(y bo)的壁很厚，对干旱、的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强）（抗逆性极强）注：不是繁殖体注：不是繁殖体第18页/共52页第十八页，共52页。干热(n r)灭菌接种环、接种针等 金属(jnsh)用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为温和(wnh)理化方法，杀死部分有害菌体（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌高压蒸汽灭菌二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染2.2.消毒与灭菌：消毒与灭菌：第19页/共52页第十九页，共52页。第20页/共52页第二十页，共52页。1.无菌技术(jsh)除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果(rgu)需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术(jsh)还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。第21页/共52页第二十一页，共52页。高压蒸气灭菌(mi jn)的原理是（）A高压使细菌DNA变性 B高压使细菌蛋白质凝固变性 C高温烫死细菌 D高温使细菌DNA变性B第22页/共52页第二十二页，共52页。二、微生物实验室培养(piyng)的基本操作程序1、器具(qj)的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存第23页/共52页第二十三页，共52页。涂布器涂布器接种接种(jizhng)环环接种接种(jizhng)针针第24页/共52页第二十四页，共52页。第25页/共52页第二十五页，共52页。四四.大肠杆菌的纯化大肠杆菌的纯化(chn hu)(chn hu)培培养：养：制备制备(zhbi)(zhbi)牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算计算(j(j sun)sun)2.称量3.3.溶化溶化牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖4.4.调调pHpH、分装、封口、分装、封口5.5.灭菌灭菌6.6.倒平板倒平板 7.7.无菌检查：无菌检查：37培养培养24-48h24-48h培养基、培养皿培养基、培养皿防琼脂糊底第26页/共52页第二十六页，共52页。第27页/共52页第二十七页，共52页。倒平板倒平板(pngbn)(pngbn)约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成防止皿盖上的水珠落入培养基，造成(zo chn)污染污染灼烧灭菌(mi jn)，防止瓶口的微生物污染培养基第28页/共52页第二十八页，共52页。答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降的温度下降(xijing)(xijing)到刚刚不烫手时，就可以进行到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过为什么需要使锥形瓶的瓶口通过(tnggu)(tnggu)火焰？火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口答：通过灼烧灭菌，防止瓶口(pn ku)(pn ku)的微的微生物污染培养基。生物污染培养基。问题讨论1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，才左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？温度？第29页/共52页第二十九页，共52页。3.3.平板冷凝平板冷凝(lngnng)(lngnng)后，为什么要将平板倒后，为什么要将平板倒置？置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心在倒平板的过程中，如果不小心(xio xn)(xio xn)将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结答：平板冷凝后，皿盖上会凝结(nngji)(nngji)水珠，水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第30页/共52页第三十页，共52页。b.纯化(chn hu)大肠杆菌接种(jizhng)方法有：平板划线法和稀释涂布平板法微生物的接种(jizhng)技术：第31页/共52页第三十一页，共52页。接种方法有：平板划线(hu xin)法和稀释涂布平板法 一、平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以(ky)分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.第32页/共52页第三十二页，共52页。将接种(jizhng)环放在火焰上灼烧，直到接种(jizhng)环_在在_旁冷旁冷却接种却接种(jizhng)(jizhng)环，环，并打开棉塞并打开棉塞 将试管(shgun)口通过火焰.将已_的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划_条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。.将试管通过火焰，并塞上棉塞 火焰冷却三至五灼烧接种环，待其冷却后，灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的从第一区域划线的_开始开始往第二区域内划线。重复以上操往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。作，在三、四、五区域内划线。注意注意不要将最后一区的划线与第不要将最后一区的划线与第一区相连一区相连。末端烧红将平板_放入培养箱中培养。倒置第33页/共52页第三十三页，共52页。二二.大肠杆菌的纯化大肠杆菌的纯化(chn hu)(chn hu)培养：培养：纯化纯化(chn hu)(chn hu)大肠杆菌：大肠杆菌：平板平板(pngbn)(pngbn)划线法：划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.接种：接种：接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）第34页/共52页第三十四页，共52页。1.1.接种环只蘸一次菌液接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连但要在培养基不同位置连续续(linx)(linx)划线多次划线多次.2.2.划线首尾不能相接划线首尾不能相接3.3.划线后划线后,培养皿倒置培养培养皿倒置培养划线划线(hu xin)分离法分离法注意事项注意事项:第35页/共52页第三十五页，共52页。答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目(shm)(shm)逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。种，避免细菌污染环境和感染操作者。问题(wnt)讨论1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束烧接种环？在划线操作结束(jish)(jish)时，仍然需要时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧接种环吗？为什么？第36页/共52页第三十六页，共52页。2.2.在灼烧接种在灼烧接种(jizhng)(jizhng)环之后，为什么要等环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？其冷却后再进行划线？答：以免接种答：以免接种(jizhng)(jizhng)环温度太高，杀死菌环温度太高，杀死菌种。种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端总是从上一次划线的末端(m dun)(m dun)开始划线？开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第37页/共52页第三十七页，共52页。二、稀释二、稀释(xsh)涂布平涂布平板分离法板分离法涂布分离法涂布分离法:是指将菌液进行一系是指将菌液进行一系列的梯度稀释列的梯度稀释,然后将不同稀释度然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养的菌液分别涂布到琼脂固体培养(piyng)基的表面，进行培养基的表面，进行培养(piyng)。在稀释度足够的菌液里，聚集在在稀释度足够的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个的细一起的微生物将分散成单个的细胞，从而能在培养胞，从而能在培养(piyng)基表基表面形成单个菌落。面形成单个菌落。第38页/共52页第三十八页，共52页。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释稀释(xsh)(xsh)涂布平板法：涂布平板法：a.a.梯度梯度(t d)(t d)稀释菌液：稀释菌液：菌液微量微量 移液器移液器第39页/共52页第三十九页，共52页。稀释稀释(xsh)(xsh)涂布平板法：涂布平板法：a.a.梯度梯度(t d)(t d)稀释菌液：稀释菌液：b.b.涂布平板涂布平板(pngbn)(pngbn)：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴灼涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍第40页/共52页第四十页，共52页。答：应从操作的各个细节保证答：应从操作的各个细节保证(bozhng)“(bozhng)“无无菌菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。灯火焰周围等等。问题(wnt)讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合结合(jih)(jih)平板划线与系列稀释的无菌操平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第作要求，想一想，第2 2步应如何进行无菌操步应如何进行无菌操作？作？第41页/共52页第四十一页，共52页。2、纯化大肠杆菌、纯化大肠杆菌平板(pngbn)划线法:稀释(xsh)涂布平板法:(1)接种(jizhng)方法.连续划线，.逐步稀释.梯度稀释，.分别涂布.第42页/共52页第四十二页，共52页。平板平板(pngbn)(pngbn)划线法：划线法：大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释稀释(xsh)(xsh)涂布平板法：涂布平板法：2.2.培养培养(piyng)(piyng)：将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37恒温箱中培养12h24h后，观察并记录第43页/共52页第四十三页，共52页。结果分析(fnx)与评价.培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 12d2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。.接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。.是否进行了及时细致是否进行了及时细致(xzh)(xzh)的观察与记录的观察与记录培养培养12h12h与与24h24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。第44页/共52页第四十四页，共52页。三三.菌种的保藏菌种的保藏(bocng)(bocng)：1.1.临时临时(ln sh)(ln sh)保藏：保藏：试管固体试管固体(gt)(gt)斜面培斜面培养基上养基上42.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020第45页/共52页第四十五页，共52页。本课题本课题(kt)(kt)知识小结知识小结:第46页/共52页第四十六页，共52页。【典例解析(ji x)】例例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是关于微生物营养物质的叙述中，正确的是()()A.A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量(nngling)(nngling)C.C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量(nngling)(nngling)解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于物的具体情况分析。对于(duy)A(duy)A、B B选项，它的表达是不完选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如氮源，如NH4HCO3NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于(duy)C(duy)C选项，除选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；自养型微生物的碳源；NaHCO3NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而无机盐；而NaClNaCl则只能提供无机盐。对于则只能提供无机盐。对于(duy)D(duy)D选项，无机选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3NH3可为硝化细菌提供能可为硝化细菌提供能量和氮源。量和氮源。D第47页/共52页第四十七页，共52页。例例2 2：下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是：下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是()A.A.防止杂菌污染防止杂菌污染 B.B.消灭杂菌消灭杂菌 C.C.培养基和发酵设备都必须培养基和发酵设备都必须(bx)(bx)灭菌灭菌 D.D.灭菌必须灭菌必须(bx)(bx)在接种前在接种前解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A A说的是灭菌的目的，因说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；物（杂菌），所以是正确的；B B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C C是正确的，是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须后专门接种的，灭菌必须(bx)(bx)在接种前，如果接种后再灭菌就会把所在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。接菌种也杀死。B第48页/共52页第四十八页，共52页。编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 .（提示(tsh)：金黄色葡萄球菌具耐盐性）自养(z yn)型微生物 含碳有机物 第49页/共52页第四十九页，共52页。（3）若除去成分，加入(jir)（CH2O），该培养基可用于培养 。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。固氮(dn)微生物 3 调整(tiozhng)pH 编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml第50页/共52页第五十页，共52页。（6）右表中各成分重量确定的原则是 。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该(ynggi)增加的成分 。依微生物的生长需要(xyo)确定 琼脂(qingzh)（或凝固剂）编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml第51页/共52页第五十一页，共52页。感谢您的观看(gunkn)！第52页/共52页第五十二页，共52页。