理学酶工程学习.pptx

2023/3/191酶工程的内容酶工程的内容（1）对天然酶的开发和生产）对天然酶的开发和生产（包括微生物酶的（包括微生物酶的发酵和提取以及从动植物中提取酶的技术）、发酵和提取以及从动植物中提取酶的技术）、包包括酶的分离纯化及鉴定技术；括酶的分离纯化及鉴定技术；（2）酶分子的修饰技术，人工设计及与其他生）酶分子的修饰技术，人工设计及与其他生物技术领域的交叉和渗透。物技术领域的交叉和渗透。（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；）酶反应器的研制和应用；其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。值才真正得以体现。应应应应用用用用第1页/共83页2023/3/194一、酶制剂的生产一、酶制剂的生产第4页/共83页2023/3/195（一）酶的提取与分离纯化（一）酶的提取与分离纯化目目的的：把把酶酶从从生生物物体体中中提提取取出出来来，使使之之与与杂杂质质分分开开而而达达到到与与使使用用目目的的相相适适应应的的纯纯度度；防防酶酶变变性失活。性失活。1.1.酶生产原料选择酶生产原料选择酶生产原料选择酶生产原料选择（1 1）对酶源的要求）对酶源的要求）对酶源的要求）对酶源的要求1 1）酶含量丰富）酶含量丰富）酶含量丰富）酶含量丰富2 2）提取、纯化方便）提取、纯化方便）提取、纯化方便）提取、纯化方便（2 2）微生物作为酶的优势）微生物作为酶的优势）微生物作为酶的优势）微生物作为酶的优势1 1）易得到所需的酶类）易得到所需的酶类）易得到所需的酶类）易得到所需的酶类2 2）易获得高产菌株）易获得高产菌株）易获得高产菌株）易获得高产菌株3 3）生产成本低）生产成本低）生产成本低）生产成本低4 4）微生物生长周期短）微生物生长周期短）微生物生长周期短）微生物生长周期短5 5）提高微生物产酶能力的途径较多）提高微生物产酶能力的途径较多）提高微生物产酶能力的途径较多）提高微生物产酶能力的途径较多 第5页/共83页2023/3/196（3）对酶生产菌的要求1）不是致病菌，也不产毒素2）不易变异退化，不易感染噬菌体3）产酶量高，而且最好产生胞外酶4）原料廉价，周期短，易培养第6页/共83页2023/3/197第7页/共83页2023/3/198离子交换浓缩超滤凝胶干燥浓缩分离纯化酶的结晶粗提酶液脱盐凝胶过滤透析 离子交换层 析 凝胶色谱层 析等亲和层析等电聚集等一种新型的微生物酶纯化手段一种新型的微生物酶纯化手段制备型聚丙烯制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳 (未被广泛应用于酶的制备未被广泛应用于酶的制备)3、酶的生产及分离纯化第8页/共83页2023/3/199 性质性质 方法方法v分子大小分子大小 透析、超滤、差速离心、凝透析、超滤、差速离心、凝胶过滤胶过滤v溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀剂沉淀v电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析v吸附性质吸附性质 吸附层析吸附层析v对配体分子对配体分子 的生物亲和力的生物亲和力 亲和层析亲和层析酶分离纯化常用方法第9页/共83页2023/3/1912（1 1）酶分离的沉淀技术）酶分离的沉淀技术 1 1）盐析）盐析溶解度的差异溶解度的差异l向蛋白质溶液中加入大量的中性盐向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl，当溶液的离，当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析盐析（saltingout）。）。l盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，复可溶解。盐后，复可溶解。第12页/共83页2023/3/1913等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解盐溶原因？盐溶盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量盐离子量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中于水中(此时称为盐溶）盐溶第13页/共83页2023/3/1914盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（NH4）2SO4）当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。第14页/共83页2023/3/1915l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和析出析出分段盐析分子量越大，沉淀所需盐的量越少；第15页/共83页2023/3/19162）PEG沉淀法溶解度的差异空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。PEGPEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。PEGPEG沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。粒较大，收集容易。第16页/共83页2023/3/19173)3)有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法溶解度的差异溶解度的差异溶解度的差异溶解度的差异n与水互溶的极性有机溶剂如与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却至至00以下，以下，然后在不断搅拌下将其逐渐加入然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。则在很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。第17页/共83页2023/3/19184 4）等电点沉淀法）等电点沉淀法溶解度的差异溶解度的差异蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。一般用于酶的粗分离。一般用于酶的粗分离。第18页/共83页2023/3/19195）热变性沉淀法）热变性沉淀法热稳定性的差异热稳定性的差异适用于热稳定性酶。通过控制适用于热稳定性酶。通过控制T，使大量杂质蛋白变性除去。，使大量杂质蛋白变性除去。可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。第19页/共83页2023/3/1920（2 2）层析分离）层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数）的不同，使各组分分子亲和力和分配系数）的不同，使各组分的分布程度不同而达到分离。的分布程度不同而达到分离。1 1）凝胶过滤层析：）凝胶过滤层析：分分离酶蛋白时，离酶蛋白时，分子大小分子大小大于凝胶孔径的蛋白被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间大于凝胶孔径的蛋白被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。这样通过一胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的分子蛋白就被分定长度的凝胶层析柱后，大小不同的分子蛋白就被分开了。开了。第20页/共83页2023/3/1921Gel Filtration.swf第21页/共83页2023/3/1922第22页/共83页2023/3/1923原理原理:不同蛋白质等电点不同不同蛋白质等电点不同,在同一在同一pHpH介介质中电离情况不同，分子所带电荷不同质中电离情况不同，分子所带电荷不同,与离子与离子交换剂的吸附能力不同交换剂的吸附能力不同.将离子交换树脂装入层析柱。将离子交换树脂装入层析柱。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质有负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质结结合带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质合带有正电荷的蛋白质.2）离子交换层析法离子交换层析法Ion Exchange第23页/共83页2023/3/1924第24页/共83页2023/3/1925离子交换层析的基本原理物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。第25页/共83页2023/3/1926原理：原理：利用生物大分子间利用生物大分子间特异的亲和能力特异的亲和能力来纯化来纯化生物大分子，如：生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的和其互补的DNA等。等。将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结合的物质再用洗脱剂把它从柱上洗脱下来。合的物质再用洗脱剂把它从柱上洗脱下来。3 3）亲和层析法亲和层析法第26页/共83页2023/3/1927利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒具有极强的专一性具有极强的专一性第27页/共83页第28页/共83页2023/3/1929亲和层析的四个要素Affinity第29页/共83页2023/3/19304 4）高效液相色谱层析（高效液相色谱层析（HPLCHPLC）特点：特点：使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因因而分辨率很高。而分辨率很高。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。许多类型的柱层析都可用许多类型的柱层析都可用HPLCHPLC来代替，如分配层来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。第30页/共83页2023/3/1931通过高压泵，连续的将流动相按一定流通过高压泵，连续的将流动相按一定流速流过柱子，通过进样器注入样品混合物。速流过柱子，通过进样器注入样品混合物。混合物中各组分性质不同，因而它们在柱混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。内移动速度不同而逐渐分离。第31页/共83页2023/3/1932（3）酶分离纯化的电泳技术电泳电泳在外电场作用下，由于蛋白质所带在外电场作用下，由于蛋白质所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。速率也不同，从而达到分离的目的。区带电泳区带电泳样品溶液在一惰性支持物上样品溶液在一惰性支持物上进行电泳的过程。电泳后，不同的蛋白质组成进行电泳的过程。电泳后，不同的蛋白质组成被分离形成带状区间。区带的位置可用专一蛋被分离形成带状区间。区带的位置可用专一蛋白质染料染色显示，有些也可利用伴有颜色变白质染料染色显示，有些也可利用伴有颜色变化的酶催化反应来显示。化的酶催化反应来显示。第32页/共83页2023/3/1933在蛋白质组学中对电泳的分类在蛋白质组学中对电泳的分类一维电泳(one dimensional gel electrophoresis,1DE)，现在普遍采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)，又称双向电泳第33页/共83页2023/3/1934非变性电泳非变性电泳(native PAGE)(native PAGE)：迁移率由分子大小、分子形状、净电荷多少决定。迁移率由分子大小、分子形状、净电荷多少决定。SDS-PAGESDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（烷基硫酸钠（SDSSDS），蛋白质分子被大量），蛋白质分子被大量SDSSDS阴离子阴离子包裹，消除了它们间原来携带的电荷差别，电泳时包裹，消除了它们间原来携带的电荷差别，电泳时蛋白质向正极移动。因而其迁移率仅反映蛋白质分蛋白质向正极移动。因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小，故广泛用于子大小，故广泛用于蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定。一维电泳第34页/共83页2023/3/1935支持物：聚丙烯酰胺凝胶。具有分子筛的作用。支持物：聚丙烯酰胺凝胶。具有分子筛的作用。凝胶的孔隙大小通过适宜的浓度和加入交联剂（亚甲凝胶的孔隙大小通过适宜的浓度和加入交联剂（亚甲基双丙烯酰胺）加以控制基双丙烯酰胺）加以控制第35页/共83页2023/3/1936电泳条带电泳条带第36页/共83页2023/3/1937水平板式电泳槽水平板式电泳槽第37页/共83页2023/3/1938PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统和和不连续系统不连续系统两大类，两大类，连连续续系系统统电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下，主主要要靠靠电电荷荷和分子筛效应。和分子筛效应。不不连连续续系系统统中中由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效效应应，因因而而其其分分离离条条带带清清晰晰度度及及分辨率均较前者佳。分辨率均较前者佳。第38页/共83页2023/3/1939浓度梯度凝胶电泳浓度梯度凝胶电泳从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为如通常顶部凝胶浓度为5 5，底部凝胶浓度为，底部凝胶浓度为2525。梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。同时分离较大范围分子量的蛋白质。另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。第39页/共83页2023/3/1940等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳IEFEIEFEIsoelectric Focusing Isoelectric Focusing ElectrophoresisElectrophoresisIEFE一种利用具有一种利用具有pH梯度梯度的支持介质分离的支持介质分离等电等电点不同点不同的蛋白质的电泳技术。的蛋白质的电泳技术。各种蛋白质各自都有一个等电点各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的在一特殊的pH环境中环境中,蛋白质分子呈电中性蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。在电场中不会迁移。等电聚焦等电聚焦就是在电泳介质中放入就是在电泳介质中放入载体两性电解载体两性电解质质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳阳极到阴极逐步增加的极到阴极逐步增加的pH梯度梯度，在此体系中，不同，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。等电点聚焦也称为聚焦电泳。第40页/共83页2023/3/1942常用支持介质常用支持介质：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，其中聚丙烯酰胺凝胶最常用丙烯酰胺凝胶，其中聚丙烯酰胺凝胶最常用载体两性电解质载体两性电解质:一系列一系列脂肪族多氨基多羧酸脂肪族多氨基多羧酸同同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的相互连接的pIpI值。在外电场作用下，自然形成值。在外电场作用下，自然形成pHpH梯度，是一种特殊的缓冲液。梯度，是一种特殊的缓冲液。pH范围：pH310丙烯酸+多乙烯多胺Ampholine（LKB）加成反应第42页/共83页2023/3/1943没通电时的变化没通电时的变化 所所有有的的载载体体两两性性电电解解质质分分子子都都荷荷电电，只只是是溶溶液液中中荷荷正正电电和和荷荷负负电电的的基基团团数数目目相相等等，净电荷为零。净电荷为零。第43页/共83页2023/3/1944引入电场时的变化引入电场时的变化 载载体体两两性性电电解解质质分分子子将将向向阴阴极极或或阳阳极极迁迁移移，带带有有最最低低等等电电点点的的分分子子（荷荷最最多多的的负负电电）将将最最快快地地向向阳阳极极迁迁移移。当当它它达达到到净净电电荷荷是是零零的的位位置置时才停止。时才停止。其其次次一一些些低低pIpI的的载载体体两两性性电电解解质质分分子子（荷荷其其次次多多的的负负电电）也也将将向向阳阳极极移移动动，直直到到它它的的净净电荷被减少到零才停止。电荷被减少到零才停止。第44页/共83页2023/3/1946电泳结束后的变化电泳结束后的变化所有的载体两性电解质分所有的载体两性电解质分子以增加子以增加pIpI级数的办法将级数的办法将分别在阳、阴极之间到达分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一它们自己的位置而给出一个个pIpI梯度。梯度。蛋白质在此蛋白质在此pHpH梯度凝梯度凝胶中泳动，当迁移至胶中泳动，当迁移至pHpH值值等于等于pIpI处时，就不再泳动，处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。而被浓缩成狭窄的区带。第46页/共83页2023/3/1947第47页/共83页2023/3/1948双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。第48页/共83页2023/3/1949什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶（细胞）（细胞）水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶或细胞水不溶性酶或细胞（固定化酶或细胞）（固定化酶或细胞）固定化技术固定化技术二、固定化酶及固定化细胞 固定化技术及应用第49页/共83页2023/3/1950酶在使用过程中酶在使用过程中酶在使用过程中酶在使用过程中：1.1.稳定性差易变性失活稳定性差易变性失活稳定性差易变性失活稳定性差易变性失活2.2.只能在水溶液中催只能在水溶液中催只能在水溶液中催只能在水溶液中催化底物反应化底物反应化底物反应化底物反应3.3.反应后与底物混在一反应后与底物混在一反应后与底物混在一反应后与底物混在一起难回收起难回收起难回收起难回收4.4.产物分离纯化困难产物分离纯化困难产物分离纯化困难产物分离纯化困难固定化酶：固定化酶：固定化酶：固定化酶：1.1.保持酶稳定催化特性保持酶稳定催化特性保持酶稳定催化特性保持酶稳定催化特性2.2.长时间反复使用，利于长时间反复使用，利于长时间反复使用，利于长时间反复使用，利于连续自动化生产连续自动化生产连续自动化生产连续自动化生产3.3.利于产物分离纯化利于产物分离纯化利于产物分离纯化利于产物分离纯化缺点：缺点：固定化过程中有时会引固定化过程中有时会引起酶的失活起酶的失活第50页/共83页2023/3/1951细胞的固定化方法细胞的固定化方法固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。是是将完整细胞固定将完整细胞固定在载体上的技术在载体上的技术:(1)(1)它免去了破碎细胞提取酶等步骤，直接利它免去了破碎细胞提取酶等步骤，直接利用细胞内的酶，用细胞内的酶，(2)(2)固定后酶活基本没有损失。固定后酶活基本没有损失。(3)(3)细胞生长快、而且多、反应快。细胞生长快、而且多、反应快。(4)(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。第51页/共83页2023/3/19521 1.吸附法吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法（二）固定化方法吸附法包埋法结合法交联法分类分类第52页/共83页2023/3/1953常用吸附剂常用吸附剂活性炭、氧化铝、硅藻土、活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。废水处理中的生物膜法是其代表性的例子。固定化对于吸附载体的要求包括：固定化对于吸附载体的要求包括：无生物毒抗物理降解、具有抗化无生物毒抗物理降解、具有抗化学降解、抗生物降解的稳定性，学降解、抗生物降解的稳定性，具有一定的机械强度和结构稳定具有一定的机械强度和结构稳定性。性。第53页/共83页2023/3/19542 2、包埋法、包埋法将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分子将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分子半透膜内的固定方法；前者又称为凝胶包埋法，半透膜内的固定方法；前者又称为凝胶包埋法，后者则称为微囊法。后者则称为微囊法。包埋法一般较少改变酶的高级结构，酶的回收包埋法一般较少改变酶的高级结构，酶的回收包埋法一般较少改变酶的高级结构，酶的回收包埋法一般较少改变酶的高级结构，酶的回收率较高；但它仅适用于小分子底物和产物的酶，因率较高；但它仅适用于小分子底物和产物的酶，因率较高；但它仅适用于小分子底物和产物的酶，因率较高；但它仅适用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进入载体的网格。为只有小分子物质才能扩散进入载体的网格。为只有小分子物质才能扩散进入载体的网格。为只有小分子物质才能扩散进入载体的网格。1 1）凝胶包埋法）凝胶包埋法）凝胶包埋法）凝胶包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种凝将酶或含酶菌体包埋在各种凝将酶或含酶菌体包埋在各种凝将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶，大胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶，大胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶，大胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶，大多数为球状或片状。多数为球状或片状。多数为球状或片状。多数为球状或片状。常用凝胶常用凝胶常用凝胶常用凝胶天然凝胶（琼脂凝胶、角叉菜胶、天然凝胶（琼脂凝胶、角叉菜胶、天然凝胶（琼脂凝胶、角叉菜胶、天然凝胶（琼脂凝胶、角叉菜胶、明胶等）和合成凝胶（聚丙烯酰胺凝胶等）明胶等）和合成凝胶（聚丙烯酰胺凝胶等）明胶等）和合成凝胶（聚丙烯酰胺凝胶等）明胶等）和合成凝胶（聚丙烯酰胺凝胶等）第54页/共83页2023/3/1955图5-3聚丙烯酰胺凝胶制成固定化细胞的结构 第55页/共83页2023/3/1956第56页/共83页2023/3/1957第57页/共83页2023/3/1958第58页/共83页2023/3/19592 2）微囊法微囊法微囊法微囊法是利用各类型的膜将是利用各类型的膜将是利用各类型的膜将是利用各类型的膜将微生物细胞微生物细胞（酶）封闭起来，这类膜能使低分子产物和底酶）封闭起来，这类膜能使低分子产物和底酶）封闭起来，这类膜能使低分子产物和底酶）封闭起来，这类膜能使低分子产物和底物通过，而酶和其他高分子物质不能通过，所物通过，而酶和其他高分子物质不能通过，所物通过，而酶和其他高分子物质不能通过，所物通过，而酶和其他高分子物质不能通过，所以以以以只适合底物和产物都是小分子物质的酶的固只适合底物和产物都是小分子物质的酶的固只适合底物和产物都是小分子物质的酶的固只适合底物和产物都是小分子物质的酶的固定。定。定。定。第59页/共83页2023/3/19603 3、结合法、结合法1）离子键结合法离子键结合法 通过离子键使酶通过离子键使酶(或细胞或细胞)与载体结合的固定化方法。与载体结合的固定化方法。载体载体不溶于水的离子交换剂不溶于水的离子交换剂:离子交换树脂离子交换树脂特点特点操作简单、条件温和、不会使酶失活；操作简单、条件温和、不会使酶失活；结合力弱、易脱落。结合力弱、易脱落。使用时一定要严格控制好使用时一定要严格控制好pH值、离子强度和温度。值、离子强度和温度。第60页/共83页2023/3/19612）共价键结合共价键结合选择适宜的载体，使选择适宜的载体，使之通过共价键与酶结合在一起的固定化方法。之通过共价键与酶结合在一起的固定化方法。载体载体纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物。物。第61页/共83页2023/3/19624.4.交联固定化法（新型）交联固定化法（新型）交联固定化法不使用载体，而是通过物理或者交联固定化法不使用载体，而是通过物理或者化学手段使细胞之间彼此附着相连，因此可分为物化学手段使细胞之间彼此附着相连，因此可分为物理交联法和化学交联法两种。理交联法和化学交联法两种。物理交联法：物理交联法：利用细胞自絮凝形成颗粒（颗粒污泥）作为固利用细胞自絮凝形成颗粒（颗粒污泥）作为固定化的方法，此法在高浓度有机废水的处理方面正定化的方法，此法在高浓度有机废水的处理方面正在发挥越来越大的作用。在发挥越来越大的作用。活性污泥系统中菌胶团的形成及厌氧污泥场中活性污泥系统中菌胶团的形成及厌氧污泥场中颗粒污泥的产生均是通过细胞间自絮凝而实现的物颗粒污泥的产生均是通过细胞间自絮凝而实现的物理交联。理交联。第62页/共83页2023/3/1963化学交联法化学交联法通过双功能或多功能试剂，在通过双功能或多功能试剂，在酶分子间形成共价键的连接方法。酶分子间形成共价键的连接方法。双功能试剂：双功能试剂：O O常用的是戊二醛常用的是戊二醛 H C CH2 CH2 CH2 C H（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶第63页/共83页2023/3/1964在在没没有有其其它它载载体体参参与与，仅仅通通过过酶酶分分子子间间交交联联形形成成的的固固定定化化酶酶，颗颗粒粒很很小小，而而且且机机械械性性能能不不佳佳，为为克克服服这这一一缺缺点点，一一般般可可先先将将酶酶吸吸附附于于载载体体上上，或或者者包包埋埋于于胶胶内内或或微微囊囊内内，然然后后再再交交联联制制成成固固定定化化酶酶“网网”膜膜或或“网网”颗颗粒粒。这这种种方法又称为双重固定化法。方法又称为双重固定化法。第64页/共83页2023/3/1965 (三三)固定化酶的性质固定化酶的性质 酶酶分分子子经经固固相相化化后后，从从游游离离态态变变为为结结合合态态。酶酶分分子子处处在在一一个个与与游游离离态态酶酶完完全全不不同同的的微微环环境境中中，微微环环境境的的许许多多性性质质会会影影响响酶酶原原有有的的性性质质。如如微微环环境境的的化化学学组组成成，与与酶酶相相结结合合的的表表面面结结构构，底底物物进进入入与与底底物物排排出出微微环环境境的的速度，微环境的局部速度，微环境的局部pHpH等。等。第65页/共83页2023/3/19661.1.1.1.稳定性：稳定性：稳定性：稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高，固相酶的稳定性比游离酶高，固相酶的稳定性比游离酶高，固相酶的稳定性比游离酶高，（1 1 1 1）热稳定性：）热稳定性：）热稳定性：）热稳定性：固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶热热热热稳稳稳稳定定定定性性性性较较较较之之之之天天天天然然然然酶酶酶酶提提提提高高高高。如如如如氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸酰酰酰酰化酶化酶化酶化酶第66页/共83页2023/3/1967(2)(2)(2)(2)对蛋白酶水解作用稳定性：对蛋白酶水解作用稳定性：对蛋白酶水解作用稳定性：对蛋白酶水解作用稳定性：固固固固相相相相酶酶酶酶比比比比天天天天然然然然酶酶酶酶有有有有更更更更强强强强的的的的抵抵抵抵抗抗抗抗蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶水水水水解解解解作作作作用用用用的的的的能力。能力。能力。能力。第67页/共83页2023/3/1968(3)(3)(3)(3)对变性试剂作用的稳定性：对变性试剂作用的稳定性：对变性试剂作用的稳定性：对变性试剂作用的稳定性：固固固固相相相相酶酶酶酶对对对对各各各各种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白变变变变性性性性剂剂剂剂的的的的稳稳稳稳定定定定性性性性，一一一一般般般般都都都都比比比比天天天天然然然然酶强。酶强。酶强。酶强。第68页/共83页2023/3/1969(4)4)4)4)保藏稳定性：保藏稳定性：保藏稳定性：保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。固相酶比天然酶保存的时间更长。固相酶比天然酶保存的时间更长。固相酶比天然酶保存的时间更长。如如如如：天天天天然然然然胰胰胰胰凝凝凝凝乳乳乳乳蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶在在在在pH4.1pH4.1pH4.1pH4.1，4444保保保保存存存存4 4 4 4个个个个月月月月，残残残残留留留留活活活活力力力力仅仅仅仅为为为为原原原原活活活活力力力力的的的的2%2%2%2%。偶偶偶偶联联联联于于于于琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖后后后后，在在在在同同同同样样样样条条条条件件件件下下下下，却却却却可可可可保保保保存存存存82%82%82%82%的的的的活活活活力力力力，因因因因此此此此固固固固相相相相酶酶酶酶有利于运输、贮存和重复使用。有利于运输、贮存和重复使用。有利于运输、贮存和重复使用。有利于运输、贮存和重复使用。第69页/共83页2023/3/19702.2.2.2.最适温度：最适温度：最适温度：最适温度：(1)(1)(1)(1)固固固固相相相相酶酶酶酶的的的的最最最最适适适适温温温温度度度度一一一一般般般般比比比比天天天天然然然然酶酶酶酶高高高高，个个个个别别别别会会会会有有有有所所所所降低。降低。降低。降低。例例例例如如如如：用用用用重重重重氮氮氮氮法法法法制制制制备备备备的的的的固固固固定定定定化化化化胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶和和和和胰胰胰胰凝凝凝凝乳乳乳乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5 5 5 510101010；以以以以共共共共价价价价结结结结合合合合法法法法固固固固定定定定化化化化的的的的色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸酶酶酶酶，其其其其最最最最适适适适温温温温度度度度比比比比游离酶高游离酶高游离酶高游离酶高5 5 5 515151515。第70页/共83页2023/3/1971 (2)(2)(2)(2)同同同同种种种种酶酶酶酶，采采采采用用用用不不不不同同同同的的的的方方方方法法法法或或或或不不不不同同同同载载载载体体体体固固固固定定定定化化化化后，其最适温度可能不同。后，其最适温度可能不同。后，其最适温度可能不同。后，其最适温度可能不同。如：如：如：如：氨基酰化酶氨基酰化酶氨基酰化酶氨基酰化酶 用用用用DEAEDEAEDEAEDEAE葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶经经经经离离离离子子子子键键键键结结结结合合合合法法法法固固固固定定定定化化化化后后后后，其其其其最最最最适适适适温温温温度度度度(72)(72)(72)(72)比比比比游游游游离离离离酶酶酶酶的的的的最最最最适适适适温温温温度度度度(60)(60)(60)(60)提提提提高高高高12121212；用用用用DEAEDEAEDEAEDEAE纤纤纤纤维维维维素素素素固固固固定定定定化化化化，其其其其最最最最适适适适温温温温度度度度(67)(67)(67)(67)比比比比游游游游离酶提高离酶提高离酶提高离酶提高7777；用用用用烷烷烷烷基基基基化化化化法法法法固固固固定定定定化化化化的的的的氨氨氨氨基基基基酰酰酰酰化化化化酶酶酶酶，其其其其最最最最适适适适温温温温度度度度却却却却比游离酶则有所降低。比游离酶则有所降低。比游离酶则有所降低。比游离酶则有所降低。第71页/共83页2023/3/19723 3、最适、最适pHpH：酶酶经经固固定定化化后后，其其作作用用的的最最适适pHpH常常会会发发生生偏移，影响固定化酶最适偏移，影响固定化酶最适PHPH的因素主要有两个。的因素主要有两个。(1)(1)载体性质对最适载体性质对最适pHpH影响：影响：用用带带负负电电荷荷载载体体制制备备的的固固定定化化酶酶，最最适适pHpH比游离酶最适比游离酶最适pHpH高。高。用用带带正正电电荷荷载载体体制制备备的的固固定定化化酶酶，最最适适pHpH比游离酶最适比游离酶最适pHpH低。低。用用不不带带电电荷荷载载体体制制备备的的固固定定化化酶酶，最最适适pHpH一般不改变。一般不改变。第72页/共83页2023/3/1973(2)(2)产物性质对最适产物性质对最适pHpH影响；影响；若若酶酶催催化化反反应应产产物物为为酸酸性性时时，固固定定化化酶酶最适最适pHpH比游离酶的最适比游离酶的最适pHpH要高。要高。若若酶酶催催化化反反应应产产物物为为碱碱性性时时，固固定定化化酶酶最适最适pHpH比游离酶的最适比游离酶的最适PHPH要低。要低。若若酶酶催催化化反反应应产产物物为为中中性性时时，固固定定化化酶酶最适最适pHpH不变。不变。第73页/共83页2023/3/19744 4、底物特异性：、底物特异性：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。化后专一性会发生变化。如如：胰胰蛋蛋白白酶酶既既可可作作用用于于高高分分子子的的蛋蛋白白质质，又又可可作作用用于于低低分分子子的的二二肽肽或或多多肽肽，固固定定在在羧羧甲甲基基纤纤维维素素上上的的胰胰蛋蛋白白酶酶，对对二二肽肽或或多多肽肽的的作作用用保保持持不不变变，而而对对酪酪蛋蛋白的作用仅为游离酶的白的作用仅为游离酶的3 3左右左右.以以羧羧甲甲基基纤纤维维素素为为载载体体经经迭迭氮氮法法制制备备的的核核糖糖核核酸酸酶酶，当当以以核核糖糖核核酸酸为为底底物物时时，催催化化速速度度仅仅为为游游离离酶