课题土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.pptx

一、课题背景一、课题背景1 1、尿素尿素的利用的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+H+H2 2O O+CO+CO2 2NHNH3 3第1页/共50页3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。某些真菌和放线菌。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路.筛选菌株.统计菌落数目.设置对照第2页/共50页 1 1、实例：、实例：PCRPCR技术技术技术技术启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的时要根据它对生存环境的要求，到要求，到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来的科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来的原因：原因：原因：原因：热泉热泉热泉热泉温度温度温度温度70707070808080800 0 0 0C C C C，淘汰了绝大多数微生物只有，淘汰了绝大多数微生物只有，淘汰了绝大多数微生物只有，淘汰了绝大多数微生物只有TaqTaqTaqTaq细菌细菌细菌细菌被筛选出来，被筛选出来，被筛选出来，被筛选出来，这样也适用于实验室中微生物的筛选。这样也适用于实验室中微生物的筛选。DNADNA多聚酶多聚酶链式反应链式反应是是一种在一种在体外将少量体外将少量DNADNA大量复制大量复制(PCR)(PCR)的技术，的技术，此项技术要求使用此项技术要求使用耐高耐高温（温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合聚合酶。酶。.筛选菌株筛选菌株第3页/共50页 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；括营养、生理、生长条件等；方法：方法：抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长造成有利于该菌生长的环境造成有利于该菌生长的环境结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温包括营养、温度、度、pHpH等等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。第4页/共50页15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？固体培养基固体培养基选择培养基第5页/共50页在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素氮源：尿素思考：该培养基对微生物 （具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是 。具有具有只有能够以尿素作只有能够以尿素作为氮源的微生物才为氮源的微生物才能在该培养基上生能在该培养基上生长长第6页/共50页培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。第7页/共50页1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。（二）.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点第8页/共50页（比例计数法）待测样品待测样品等量的已知含量的红细胞等量的已知含量的红细胞 混匀混匀涂抹涂抹测定：测定：红细胞数目红细胞数目细菌数目细菌数目计算单位体积内的细菌数目计算单位体积内的细菌数目 将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。细菌红细胞【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。第9页/共50页举例：已知红细胞浓度为M个/mL，从体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？XNM YW(个)观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数红细胞含量/细菌含量 公 式 第10页/共50页2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。第11页/共50页某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4 B第12页/共50页如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算教材P22第13页/共50页实例分析P22第14页/共50页实例分析P22 第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。第15页/共50页注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在5050个左右为最好。第16页/共50页设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A A同学的结果与其他同学不同，可能同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。的解释有两种。一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。第17页/共50页小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第18页/共50页菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养根据图示根据图示27填写以下实验流程：填写以下实验流程：试验设计：第19页/共50页二.实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。第20页/共50页 准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基选择培养基将菌将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照对照，用来，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。每个。每个稀释度下需要稀释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要培养基，因此共需要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8 8个个灭菌的试灭菌的试管和管和1 1个个灭菌的移液管。灭菌的移液管。第21页/共50页应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数的平板 三三 样品的稀释样品的稀释第22页/共50页 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。每个稀释度下需要。每个稀释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要膏蛋白胨培养基，因此共需要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8 8个个灭灭菌的试管和菌的试管和1 1个个灭菌的移液管。灭菌的移液管。第23页/共50页 为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。第24页/共50页.取样涂布取样涂布实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。试验不精确，需要重新实验。第25页/共50页.微生物的培养与观察并计数微生物的培养与观察并计数 在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30303737培养1 12d2d 放线菌：25252828培养5 57d7d 霉菌：25252828的温度下培养3 34d4d。第26页/共50页 当菌落数目稳定时，选取菌落数在当菌落数目稳定时，选取菌落数在3030300300的平板进行计数。在同一稀释度下，的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对至少对3 3个平板进行重复计数，然后求出个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。算出样品中细菌的数目。第27页/共50页微生物的培养与观察微生物的培养与观察第28页/共50页第29页/共50页第30页/共50页第31页/共50页第32页/共50页第33页/共50页第34页/共50页思考思考在研究未知微生物时务必规范操作，在研究未知微生物时务必规范操作，以防被以防被致病微生物致病微生物感染，实验后一定要洗手。感染，实验后一定要洗手。第35页/共50页操作提示操作提示 一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。的稀释度等。三三三三 规划时间规划时间规划时间规划时间 三、三、第36页/共50页四、课题成果与评价四、课题成果与评价 （一）培养物中是否有杂菌污染以（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目培养基的数目，说明选择培养基已筛选，说明选择培养基已筛选出一些菌落。出一些菌落。第37页/共50页如果学生选取的是同一种土样，统计的结如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。分析产生差异的原因。（二）样品的稀释操作是否成功（二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致（三）重复组的结果是否一致第38页/共50页五、五、课外延伸课外延伸 鉴定鉴定：筛选后必鉴定：筛选后必鉴定 鉴别鉴别培养基培养基：加入某种指示剂或化学药品，加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存不影响微生物的生存1 1、酚红培养基：、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲脲酶阳性酶阳性2 2、伊红、伊红美蓝培养基：美蓝培养基：鉴定大肠杆菌。鉴定大肠杆菌。原理：代谢产物与伊红原理：代谢产物与伊红美蓝美蓝结合结合 菌落呈深紫色并带有金属光菌落呈深紫色并带有金属光泽。泽。第39页/共50页伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基是鉴别培养基，可以是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的为的代谢产物与伊红代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并带有金属光泽深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。制其他微生物的生长。例如：鉴别大肠杆菌培养基例如：鉴别大肠杆菌培养基第40页/共50页大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 第41页/共50页本课题知识小结本课题知识小结:第42页/共50页课后练习2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。第43页/共50页第44页/共50页1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌 B.B.培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和N N2 2 B.B.葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素 D.D.葡萄糖和尿素实践训练A A C CD D第45页/共50页4.4.下列说法不正确的是（）A.A.科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶 B.B.统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以M3M3作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.A.较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物 D.D.高浓度食盐B BC C第46页/共50页（09，宁夏，15分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。答案:（1）温度 酸碱度 易培养 生活周期短 （2）灭菌 消毒 损伤DNA的结构 （3）比例合适 （4）鉴定(或分类)（5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生.（6）灭菌第47页/共50页感谢您的观看！第50页/共50页