维生素的测定.pptx

（1 1）维生素的分类及生理功能）维生素的分类及生理功能（2 2）测定的目的和意义）测定的目的和意义（3 3）维生素的测定方法）维生素的测定方法第1页/共58页 1 1、维生素的分类及生理功能、维生素的分类及生理功能功能功能：维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物。它的结构复杂，种维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物。它的结构复杂，种类多，目前已经确认的有类多，目前已经确认的有3030多种，其中有多种，其中有2020种被认为与维持人体健康和促进生长发育种被认为与维持人体健康和促进生长发育是至关重要的。维生素的主要功能是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，人体对它的是至关重要的。维生素的主要功能是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，人体对它的需要量极少，但作用非常大。它一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必需要量极少，但作用非常大。它一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相关新陈代谢的紊乱，出现须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相关新陈代谢的紊乱，出现各种特有的症状。各种特有的症状。第2页/共58页分类：分类：按维生素溶解性能可将它们分成两大按维生素溶解性能可将它们分成两大类：类：v一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的，一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的，叫脂溶性维生素（如叫脂溶性维生素（如A A、D D、E E、K K等）；等）；v另一类是能溶解在水中的，叫水溶性另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如维生素（如B B1 1、B B2 2、B B6 6、C C、B B1212等）。等）。第3页/共58页2、测定的目的和意义 多数维生素的性质是不稳定的，对光、氧、热、多数维生素的性质是不稳定的，对光、氧、热、PHPH等非常敏感，食物在加工、储存、等非常敏感，食物在加工、储存、运输、销售等一系列环节都可能造成维生素的损失。为了弥补这种损失，维生素常常作运输、销售等一系列环节都可能造成维生素的损失。为了弥补这种损失，维生素常常作为强化剂在食品工业的某些产品中使用。为强化剂在食品工业的某些产品中使用。第4页/共58页意义：意义：（1 1）可评价食品的营养价值；）可评价食品的营养价值；（2 2）开发利用富含维生素的食品；）开发利用富含维生素的食品；（3 3）可以研究食品在不同的加工、储存条件下的稳定性，进而指导人们制定合理的）可以研究食品在不同的加工、储存条件下的稳定性，进而指导人们制定合理的工艺条件，减少维生素的损失；工艺条件，减少维生素的损失；（4 4）起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒。）起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒。第5页/共58页 3 3、维生素的测定方法、维生素的测定方法微生物法：微生物法：基于某种微生物生长需要特定的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需基于某种微生物生长需要特定的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊仪器，样品不需经特殊处理，但只能测定水溶性维生素。要特殊仪器，样品不需经特殊处理，但只能测定水溶性维生素。化学法：化学法：比色法、滴定法比色法、滴定法仪器法：仪器法：色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。特别是色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。特别是HPLCHPLC可用于大多数维生素的测定，可用于大多数维生素的测定，并且在某些条件下可同时分析几种维生素，但分析费用较高。并且在某些条件下可同时分析几种维生素，但分析费用较高。应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析方法应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析方法第6页/共58页重点讲解的方法：重点讲解的方法：高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC法）同时测定脂溶性维生素法）同时测定脂溶性维生素A A和维生素和维生素E E比色法测定维生素比色法测定维生素A AHPLCHPLC法测定胡萝卜素法测定胡萝卜素荧光法测定荧光法测定 B B1 1、B B2 2滴定法和比色法测定维生素滴定法和比色法测定维生素C C第7页/共58页A A、E E的测定（的测定（HPLCHPLC法）法）VAVA的性质的性质：维生素维生素A A是是-紫罗酮环与一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。通常所说的维紫罗酮环与一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。通常所说的维生素生素A A是指视黄醇或视黄醇醋酸酯。是指视黄醇或视黄醇醋酸酯。因有许多不饱和链，故见光易分解；因有许多不饱和链，故见光易分解；在在缺缺氧氧情情况况下下，对对热热较较稳稳定定，对对光光特特别别敏敏感感。如如测测强强化化奶奶粉粉时时，速速度度要要快快，一一般般要要求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定；不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定；第8页/共58页VEVE的性质的性质：又称生育酚，目前已经确认的有又称生育酚，目前已经确认的有8 8种异构体，最常见的有种异构体，最常见的有、-生育酚。溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱性环境中稳定，无氧生育酚。溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱性环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性环境中也相对稳定。条件下，对热、光及碱性环境中也相对稳定。VEVE广泛分布在各种粮食的胚和植物油中。广泛分布在各种粮食的胚和植物油中。第9页/共58页 测定原理：测定原理：（1 1）液相色谱的原理）液相色谱的原理：液相色谱是采用液体为流液相色谱是采用液体为流动相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、动相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装进样装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装置等部分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容置等部分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由器吸取作为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装置导入，随流动相在色谱柱内进行分离。进样装置导入，随流动相在色谱柱内进行分离。分离后的组分进入检测器检测，并用记录仪绘出分离后的组分进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其他数据处理装置相连，由数据处色谱图，或与其他数据处理装置相连，由数据处理系统进行数据处理理系统进行数据处理 色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点作图。点作图。第10页/共58页（2 2）高效液相色谱检测样品中的维生）高效液相色谱检测样品中的维生素素A A、E E的原理：的原理：样品中的维生素样品中的维生素E E及及维生素维生素A A经皂化提取处理后，将其从不经皂化提取处理后，将其从不皂化部分提取至有机溶剂中。用高效皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法液相色谱法C18C18反相柱将维生反相柱将维生E E和维生和维生素素A A分离，经紫外检测器检测，并用内分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量标法定量第11页/共58页（3 3）什么是内标法？）什么是内标法？取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注中，调制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积或入色谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高的比例为纵坐标，峰高和内标物质的峰面积或峰高的比例为纵坐标，取标准被测成分量和内标物质量之比或标准被测成取标准被测成分量和内标物质量之比或标准被测成分量为横坐标，制成标准曲线。分量为横坐标，制成标准曲线。然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样液时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，样液时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，然后按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，然后按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之比，再按标准曲线来求出被测成分的含量。或峰高之比，再按标准曲线来求出被测成分的含量。内标物的选取原则：内标物的选取原则：能与被测成分完全分离，但能与被测成分完全分离，但其保留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物质。其保留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物质。第12页/共58页 试剂试剂（1 1）无水乙醚：不含有过氧化物。）无水乙醚：不含有过氧化物。（2 2）无水乙醇：不得含有醛类物质。）无水乙醇：不得含有醛类物质。（3 3）无水硫酸钠。）无水硫酸钠。（4 4）甲醇：重蒸后使用。）甲醇：重蒸后使用。（5 5）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。（6 6）抗坏血酸溶液（）抗坏血酸溶液（100100g gL L）：）：临用前进行配制。临用前进行配制。（7 7）氢氧化钾溶液（）氢氧化钾溶液（5050g g100g100g）：）：取取5050g g氢氧化氢氧化钾钾,溶于溶于5050g g水中，混匀水中，混匀第13页/共58页 标准溶液的配制标准溶液的配制（1 1）维生素维生素 A A标准液：视黄醇（纯度标准液：视黄醇（纯度8585）或视黄）或视黄醇乙酸酯（纯度醇乙酸酯（纯度9090）经皂化处理后使用。用脱醛）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素乙醇溶解维生素A A标准品，使其浓度大约为标准品，使其浓度大约为lmg/mLlmg/mL。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。（2 2）维生素）维生素E E标准液：标准液：a a-生育酚（纯度生育酚（纯度9595），），-生生育酚（纯纯育酚（纯纯9595），），-生育酚（纯度生育酚（纯度9595）。用脱）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素醛乙醇分别溶解以上三种维生素E E标准品，使其浓度标准品，使其浓度大约为大约为lmg/mL,lmg/mL,临用前用紫外分光光度法分别标定此临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素三种维生素E E的准确浓度。的准确浓度。（3 3）内标溶液：称取苯并芘（纯度）内标溶液：称取苯并芘（纯度9898），用脱醛），用脱醛乙醇配制成乙醇配制成10ug/mL10ug/mL 的内标溶液。的内标溶液。第14页/共58页仪器和设备仪器和设备（1 1）高效液相色谱仪带紫外分光检测器。）高效液相色谱仪带紫外分光检测器。（2 2）旋转蒸发器。）旋转蒸发器。（3 3）高速离心机（带小塑料离心管）高速离心机（带小塑料离心管）（4 4）高纯氮气。）高纯氮气。（5 5）紫外分光光度计。）紫外分光光度计。第15页/共58页样品处理样品处理（1 1）皂化：）皂化：称取适量样品（含维生素称取适量样品（含维生素A A约约3 3gg，维生素维生素E E各异构各异构体约体约40 40 g g）于三角瓶中，加于三角瓶中，加3030mLmL无水乙醇，振摇无水乙醇，振摇使样品分散。加入使样品分散。加入 5mL100g5mL100gL L抗坏血酸溶液和抗坏血酸溶液和 2.2.0mL0mL苯并芘内标液，混匀，加苯并芘内标液，混匀，加 10 10mLmL氢氧化钾溶液氢氧化钾溶液（5050浓度），混匀，于沸水回流浓度），混匀，于沸水回流3030minmin，使皂化完使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。全，皂化后立即放入冰水中冷却。思考：思考：1 1、皂化时加入、皂化时加入VcVc的作用是什么？的作用是什么？第16页/共58页（2 2）提取：）提取：将皂化后的样品移入分液漏斗中，用将皂化后的样品移入分液漏斗中，用5050mLmL水分水分2-32-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用中。用100mL100mL无水乙醚分无水乙醚分2 2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇2 2minmin，静置分层，弃去水层。然后每次用约静置分层，弃去水层。然后每次用约5050mLmL水将乙醚液洗至中性，需洗水将乙醚液洗至中性，需洗4545次次第17页/共58页（3 3）浓缩：）浓缩：将乙醚提取液经无水硫酸钠（约将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g5g）滤入滤入150150 mL mL旋旋转蒸发瓶内，用约转蒸发瓶内，用约1515mLmL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠酸钠2 2次，并入蒸发瓶内，于次，并入蒸发瓶内，于5555水浴中减压蒸馏并水浴中减压蒸馏并回收乙醚，醚剩下约回收乙醚，醚剩下约2mL2mL时，取下蒸发瓶，用氮气时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加人吹干乙醚，随即加人2mL2mL乙醇，充分混合，溶解提乙醇，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移人塑料离心管中，于离心机上离取物。将乙醇液移人塑料离心管中，于离心机上离心心5min5min（5000r5000rminmin），），上清液供色谱分析用。上清液供色谱分析用。第18页/共58页液相色谱推荐条件：液相色谱推荐条件：分析柱：分析柱：C18C18反相柱反相柱 5 5m m，4.6mmX25Cm4.6mmX25Cm；流动相：甲醇：水流动相：甲醇：水=98=98：2 2，混匀，临用前，混匀，临用前 脱气；脱气；紫外检测器波长：紫外检测器波长：3 300nm;00nm;进样量：进样量：20 20 L L；流速：流速：1.701.70mL/minmL/min。第19页/共58页标准曲线的制备标准曲线的制备（1 1）.维生素维生素A A和维生素和维生素E E标准溶液的标定标准溶液的标定：取上述配制的维生素取上述配制的维生素A A、E E的标准溶液按一定的倍数进行稀释，在下表要求的标准溶液按一定的倍数进行稀释，在下表要求的条件下测定其吸光度，根据其吸光系数计算其的条件下测定其吸光度，根据其吸光系数计算其准确浓度。准确浓度。标准标准比吸光系数比吸光系数E E(1%,cm)(1%,cm)测定波长（测定波长（nmnm）视黄醇视黄醇18351835325325-生育酚生育酚7171294294-生育酚生育酚92.892.8298298a a-生育酚生育酚91.291.2298298第20页/共58页标准溶液浓度计算：标准溶液浓度计算：p-p-某维生素浓度，某维生素浓度，mgmgmLmL；A-A-维生素的平均紫外吸光值；维生素的平均紫外吸光值；E-E-某种维生素某种维生素l l比吸光系数比吸光系数;F-F-稀释倍数。稀释倍数。第21页/共58页（2 2）标准曲线的制备）标准曲线的制备:本方法采用内标法定量。把高、低两个浓度的维生本方法采用内标法定量。把高、低两个浓度的维生素素A A、-生育酚、生育酚、a a-生育酚、生育酚、-生育酚及内标苯并生育酚及内标苯并芘液混合，（其内标苯并芘的浓度值相同）将二种芘液混合，（其内标苯并芘的浓度值相同）将二种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。以浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素的浓度素的浓度(ug/mLug/mL）为横坐标绘制标准曲线。为横坐标绘制标准曲线。第22页/共58页第23页/共58页样品分析：样品分析：取样品处理液取样品处理液20 20 L L，用标准溶液同样的条件进行色用标准溶液同样的条件进行色谱分析，绘制色谱图。谱分析，绘制色谱图。定性：定性：根据保留时间定性根据保留时间定性定量：定量：根据色谱图求出某种维生素的峰面积与内标根据色谱图求出某种维生素的峰面积与内标物峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得待测物峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得待测维生素的含量。维生素的含量。第24页/共58页 计算：计算：式中：式中：X X某种维生素的含量，某种维生素的含量，mgmg100g100g；p p由标准曲线上查到的某种维生素含量，由标准曲线上查到的某种维生素含量，g/mLg/mL；V V样品浓缩后定容体积，样品浓缩后定容体积，mLmL；m m样品质量，样品质量，g g。第25页/共58页 说明及讨论说明及讨论 （1 1）维维生生素素极极易易被被光光破破坏坏，实实验验操操作作应应在在微微弱弱光光线线下进行，或使用棕色玻璃仪器。下进行，或使用棕色玻璃仪器。（2 2）乙乙醚醚为为溶溶剂剂的的萃萃取取体体系系，易易发发生生乳乳化化现现象象。在在提提取取、洗洗涤涤操操作作中中，不不要要用用力力过过猛猛，若若发发生生乳乳化化，可加几滴乙醇破乳。可加几滴乙醇破乳。（3 3）本本法法是是国国家家标标准准检检验验方方法法，适适用用于于各各种种食食物物和和饲料中维生素饲料中维生素A A和维生素和维生素E E的同时测定。的同时测定。（4 4）本本法法不不能能将将-生生育育酚酚-生生育育酚酚分分开开，所所以以-生生育酚的色谱峰中含有育酚的色谱峰中含有-生育酚。生育酚。第26页/共58页（5 5）维生素的含量可用国际单位（）维生素的含量可用国际单位（IUIU）表示：表示：1 1国际单位（国际单位（IUIU）=0.3 ug=0.3 ug维生素维生素A A =1mg =1mg维生素维生素E E =0.025 ug =0.025 ug维生素维生素D D第27页/共58页A A的测定的测定（三氯化锑比色法）（三氯化锑比色法）l 原理：原理：V VA A+三三氯氯化化锑锑蓝蓝色色物物质质，于于620nm620nm测测吸吸光光度度，与标准比较定量。与标准比较定量。l试剂试剂：无水无水NaNa2 2SOSO4 4、乙酸酐：吸水乙酸酐：吸水 乙醚：抽提乙醚：抽提 乙醇、乙醇、KOHKOH：皂化反应皂化反应 三氯甲烷：溶剂三氯甲烷：溶剂 三氯化锑三氯化锑-三氯甲烷：反应试剂三氯甲烷：反应试剂 酚酞：用于鉴别洗涤液中有无碱酚酞：用于鉴别洗涤液中有无碱第28页/共58页l步骤：步骤：（1 1）预处理：皂化、提取、洗涤、浓缩）预处理：皂化、提取、洗涤、浓缩（2 2）制制备备标标准准曲曲线线：用用V VA A标标准准液液绘绘制制，用用CHClCHCl3 3调调零零。注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6 6秒内秒内测定测定(3)(3)样品测定：用样品溶液代替标准液溶液。样品测定：用样品溶液代替标准液溶液。第29页/共58页l说明说明(1)(1)萃取时萃取时,不要用力过猛不要用力过猛,避免发生乳化。避免发生乳化。（2 2）氯仿中必须无水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，）氯仿中必须无水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。干扰比色测定。（3 3）由于三氯化锑与）由于三氯化锑与V VA A所产生的兰色物质不稳定，所产生的兰色物质不稳定，注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6 6秒内秒内测定。测定。（4）三氯化锑腐蚀性强，且遇水生成白色沉淀，实三氯化锑腐蚀性强，且遇水生成白色沉淀，实验用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。验用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。第30页/共58页-胡萝卜素的测定（胡萝卜素的测定（HPLCHPLC法）法）试样中的试样中的-胡萝卜素，用石油醚胡萝卜素，用石油醚+丙酮混合液提取，经三氧化铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以丙酮混合液提取，经三氧化铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，以峰高或峰面积定量。保留时间定性，以峰高或峰面积定量。注意：浓缩提取液时，防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。注意：浓缩提取液时，防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。第31页/共58页B1的测定的测定荧光法荧光法原理：硫胺素（原理：硫胺素（VBVB1 1）在碱性铁化钾溶液中被氧化为嘧噻色素，）在碱性铁化钾溶液中被氧化为嘧噻色素，在紫外线照射下，嘧噻色素发出荧光。在给定条件下，以及没在紫外线照射下，嘧噻色素发出荧光。在给定条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，荧光强度与嘧噻色素成正比，即与溶有其他荧光物质干扰时，荧光强度与嘧噻色素成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。液中硫胺素量成正比。试样在硫酸作用下试样在硫酸作用下,加热提取加热提取V VB1B1.冷却后用淀粉酶在冷却后用淀粉酶在pH=4.5pH=4.5时处时处理使理使V VB1B1分离分离如果样品中含杂质过多，应经离子交换剂处理，使如果样品中含杂质过多，应经离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液做测定。硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液做测定。测定步骤：提取测定步骤：提取净化净化氧化氧化测定测定加入淀粉酶的作用加入淀粉酶的作用:使结合态使结合态V VB1B1变为游离态变为游离态V VB1B1.第32页/共58页5.7.6、维生素、维生素B2的测定的测定荧光法荧光法原理：试样在稀盐酸中水解、酶解，调整原理：试样在稀盐酸中水解、酶解，调整 PHPH值，过滤除去蛋白值，过滤除去蛋白质等物质；试样溶液经高锰酸钾氧化，除去干扰物，再经硅镁质等物质；试样溶液经高锰酸钾氧化，除去干扰物，再经硅镁吸附剂的柱层析，提纯的核黄素在波长吸附剂的柱层析，提纯的核黄素在波长525525nmnm下发生黄绿色荧光，下发生黄绿色荧光，在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。再加入低亚硫在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。再加入低亚硫酸钠，将酸钠，将V VB2B2还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光，两者相差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。杂质的荧光，两者相差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。测定核黄素的方法还有：微生物法和测定核黄素的方法还有：微生物法和HPLCHPLC法。法。第33页/共58页讨论：P202 思考题：1、3、4第34页/共58页C C（抗坏血酸）的测定抗坏血酸）的测定 维生素维生素C C的生理功能及性质的生理功能及性质维维生生素素C C是是一一种种己己糖糖醛醛基基酸酸，有有抗抗坏坏血血病病的的作作用用，所所以以又又称称作作抗抗坏坏血血酸酸。维维生生素素C C具具有有较较强强的的还还原原性性，对对光光敏敏感感，氧氧化化后后的的产产物物称称为为脱脱氢氢抗抗坏坏血血酸酸，仍仍然然具具有有生生理理活活性性。进进一一步步水水解解则则生生成成2 2，3-3-二二酮酮古古乐乐糖糖酸酸，失失去去生生理理作作用用。在在食食品品中中，这这三三种种形形式式均均有有存存在在，但但主主要要是是前前两两者者，故故许许多多国国家家的的食食品品成成分分表表均均以以抗抗坏坏血血酸酸和和脱脱氢氢抗抗坏坏血血酸酸的的总量表示。总量表示。第35页/共58页 维生素维生素C C为白色至浅黄色晶体或结晶性粉末，受光照则逐渐变褐，干燥状态下相当稳为白色至浅黄色晶体或结晶性粉末，受光照则逐渐变褐，干燥状态下相当稳定，但在空气存在下于溶液中则迅速变质。还原型维生素定，但在空气存在下于溶液中则迅速变质。还原型维生素 C C有强还原性，有抑制多酚有强还原性，有抑制多酚氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等食品中作抗氧化剂。食品中作抗氧化剂。在新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。在新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。第36页/共58页维生素维生素C C 的测定方法的测定方法维生素维生素C C的测定方法有：的测定方法有：2 2，6-6-二氯靛酚滴定法、二氯靛酚滴定法、2 2，4 4二硝基苯肼比色法、二硝基苯肼比色法、荧光法、荧光法、高效液相色谱法。高效液相色谱法。（1 1）2 2，6-6-二氯靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸二氯靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该方法简便、灵敏，该方法简便、灵敏，但特异性差，但特异性差，样品中的其他还原性物质（如铁离子、铜离子等）会干扰测定，使结果偏高，对色深样品中的其他还原性物质（如铁离子、铜离子等）会干扰测定，使结果偏高，对色深样液的滴定终点不易辨别。样液的滴定终点不易辨别。第37页/共58页（2 2）2 2，4 4二硝基苯肼比色法和荧光法二硝基苯肼比色法和荧光法测得的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。苯肼法测得的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。苯肼法操作复杂，特异性差，易受共存物质的影响；荧光法受干扰的影响较小，结果较准确，操作复杂，特异性差，易受共存物质的影响；荧光法受干扰的影响较小，结果较准确，重现性好，但操作复杂。重现性好，但操作复杂。（3 3）高高效效液液相相色色谱谱法法可可以以同同时时测测得得抗抗坏坏血血酸酸和和脱脱氢氢抗抗坏坏血血酸酸的的含含量量，具具有有干干扰扰少少，准准确确度度高高，重重现现性性好好，灵灵敏敏、简简便便、快快速速等等优优点点，是是上上述述几几种种方方法法中中最最先先进进、可可靠靠的的方方法法。但分析成本较高。但分析成本较高。主要介绍维生素主要介绍维生素C C常用的测定方法常用的测定方法2 2，6-6-二氯靛酚滴定法、苯肼比色法二氯靛酚滴定法、苯肼比色法第38页/共58页（一）（一）2 2，6-6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法原理：还原型抗坏血酸可以还原染料还原型抗坏血酸可以还原染料2 2，6-6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中是粉红色（在中性或碱性溶液中呈蓝色）二氯靛酚。该染料在酸性溶液中是粉红色（在中性或碱性溶液中呈蓝色），被还原后颜色消失；还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一，被还原后颜色消失；还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。第39页/共58页试剂试剂 1%1%草酸溶液（草酸溶液（m/Vm/V）2%2%草酸溶液（草酸溶液（m/Vm/V）抗坏血酸标准溶液抗坏血酸标准溶液 2 2，6-6-二氯靛酚溶液二氯靛酚溶液 0.001 0.001molmolL L碘酸钾标准溶液碘酸钾标准溶液:精确称取干燥的碘酸钾精确称取干燥的碘酸钾0.35670.3567g g，用水稀释至用水稀释至100100mlml，取取出出1mL1mL，用水稀至用水稀至100100mLmL，此溶液此溶液1mL1mL相当于抗坏血酸相当于抗坏血酸0.0880.088mgmg。1%1%淀粉溶液（淀粉溶液（m/Vm/V）6%6%碘化钾溶液（碘化钾溶液（m/Vm/V）第40页/共58页抗坏血酸标准溶液的配制及标定：抗坏血酸标准溶液的配制及标定：配制配制：准确称取准确称取2020mgmg抗坏血酸，溶于抗坏血酸，溶于1 1的草酸中，并稀释至的草酸中，并稀释至100100mlml，置冰箱中保存。置冰箱中保存。用时取出用时取出5mL5mL，置于置于5050mLmL容量瓶中，用容量瓶中，用1 1草酸溶液定容，配成草酸溶液定容，配成0.020.02mg/mLmg/mL的抗坏血的抗坏血酸标准溶液。酸标准溶液。标定：标定：吸取标准使用液吸取标准使用液 5mL5mL于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入 6 6碘化钾溶液碘化钾溶液0.50.5mLmL、1 1淀粉溶液淀粉溶液3 3滴，以滴，以0.000.00lmol/Llmol/L碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。第41页/共58页C抗坏血酸标准溶液的浓度，抗坏血酸标准溶液的浓度，mg/mLmg/mL；V1V1滴定时消耗滴定时消耗 0.001 0.001molmolL L碘酸钾标准溶液的体积，碘酸钾标准溶液的体积，mLmL；V2V2滴定时所取抗坏血酸的体积，滴定时所取抗坏血酸的体积，mLmL；0.0880.088lmL0.001mollmL0.001mol碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量，碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量，mgmgmLmL一般抗坏血酸纯度为一般抗坏血酸纯度为99.5%99.5%以上，可不以上，可不标定，但要现用现配标定，但要现用现配第42页/共58页 2.2 22.2 2，6-6-二氯靛酚溶液的配制和标定二氯靛酚溶液的配制和标定 配制：配制：称取称取2 2，6-6-二氯靛酚二氯靛酚5050mgmg，溶于溶于200200mLmL含有含有5252mgmg碳酸氢钠的热水中，待冷，置于碳酸氢钠的热水中，待冷，置于冰箱中过夜。次日过滤于冰箱中过夜。次日过滤于250250mLmL棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期标定棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期标定1 1次。次。标定：标定：取取5 5mLmL已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入1 1草酸溶液草酸溶液5mL5mL，摇匀，用摇匀，用2 2，6-6-二二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色，在氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色，在1515s s不褪色为终点。不褪色为终点。第43页/共58页计算计算:式中：式中：T T每毫升染料溶液相当于抗坏血酸每毫升染料溶液相当于抗坏血酸 的毫克数，的毫克数，mgmgmLmL；c c抗坏血酸的浓度，抗坏血酸的浓度，mgmgmLmL；V1V1抗坏血酸标准溶液的体积，抗坏血酸标准溶液的体积，mLmL；V2V2消耗消耗 2 2，6-6-二氯靛酚的体积，二氯靛酚的体积，mLmL第44页/共58页测定步骤测定步骤 提取提取:鲜样的制备鲜样的制备:称称100100g g鲜样，加等量的鲜样，加等量的2 2草酸溶液，倒入组织捣碎机中打成匀浆。取草酸溶液，倒入组织捣碎机中打成匀浆。取10104040g g匀浆于匀浆于100100mLmL 容量瓶内，用容量瓶内，用1 1草酸稀释至刻度，混合均匀。草酸稀释至刻度，混合均匀。干样的制备干样的制备:称称1 14 4g g干样放入乳钵内加干样放入乳钵内加 l l草酸溶液磨成匀浆，倒入草酸溶液磨成匀浆，倒入100100mlml容量瓶中，用容量瓶中，用 1 1草酸稀释至刻度。过滤上述样液，不易过滤的可用离心机沉淀后，倾出上清液过滤备用草酸稀释至刻度。过滤上述样液，不易过滤的可用离心机沉淀后，倾出上清液过滤备用。第45页/共58页滴定：滴定：吸取吸取 5 51010mLmL滤液，置于滤液，置于 50 50mLmL三角瓶中，快速加入三角瓶中，快速加入 2,6-2,6-二氯靛酚溶液滴定，直到二氯靛酚溶液滴定，直到红色不能立即消失，而后再尽快地一滴一滴的加入（样品中可能存在其他还原性杂红色不能立即消失，而后再尽快地一滴一滴的加入（样品中可能存在其他还原性杂质，但一般杂质还原染料的速度均比抗坏血酸慢），以呈现的粉红色在质，但一般杂质还原染料的速度均比抗坏血酸慢），以呈现的粉红色在1515s s内不消失内不消失为终点。同时做空白。为终点。同时做空白。第46页/共58页 结果计算结果计算式中：式中：x-x-样品中抗坏血酸含量，样品中抗坏血酸含量，mgmg100g100g；T-1mL T-1mL染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量，染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量，mgmgmLmL；A A稀释倍数稀释倍数 V-V-滴定样液时消耗染料的体积，滴定样液时消耗染料的体积，mLmL；V V0 0-滴定空白时消耗染料的体积，滴定空白时消耗染料的体积，mLmL；m-m-样品的质量，样品的质量，g g。第47页/共58页说明说明 所有试剂最好用重蒸馏水配制。所有试剂最好用重蒸馏水配制。样样品品采采取取后后，应应浸浸泡泡在在已已知知量量的的2%2%草草酸酸溶溶液液中中，以以防防止止维维生生素素C C氧氧化化损损失失。测测定定时时整整个操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。个操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。若测动物性样品，须用若测动物性样品，须用10%10%三氯乙酸代替三氯乙酸代替2%2%草酸溶液提取。草酸溶液提取。若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土再过滤，过滤后要迅速滴定。若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土再过滤，过滤后要迅速滴定。若若样样品品中中含含有有FeFe2+2+、CuCu2+2+、SnSn2+2+、亚亚硫硫酸酸盐盐、硫硫代代硫硫酸酸盐盐等等还还原原性性杂杂质质时时，会会使使结结果果偏偏高高。第48页/共58页（二）（二）2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法原理原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗血酸经活性炭氧总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与化为脱氢抗坏血酸，再与2 2，4-4-二硝基苯肼生成红色的脎，在浓硫酸的脱水作用下，二硝基苯肼生成红色的脎，在浓硫酸的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物可转变为桔红色的无水化合物双双-2-2，4-4-二硝基苯，在浓硫酸中显色稳定，吸光度二硝基苯，在浓硫酸中显色稳定，吸光度的大小与总抗坏血酸含量成比，进行比色定量。的大小与总抗坏血酸含量成比，进行比色定量。第49页/共58页操作过程：操作过程：样品处理样品处理氧化氧化 呈色呈色 硫酸处理硫酸处理 比色比色 数据处理数据处理 （1 1）样品制备：）样品制备：同同2 2，6-6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法 （2 2）氧化处理：）氧化处理：取取 25 25mLmL上述滤液，加入上述滤液，加入 2g2g活性炭，振摇活性炭，振摇 lminlmin，过滤，弃去最初数毫过滤，弃去最初数毫升滤液。取升滤液。取1010mLmL此氧化提取液，加入此氧化提取液，加入 10 10mL 20g/LmL 20g/L的硫脲溶液，混匀。的硫脲溶液，混匀。第50页/共58页（3 3）呈色反应：）呈色反应：于三个试管中各加入于三个试管中各加入4 4mLmL经氧化的样品稀释液经氧化的样品稀释液,一个试管作为空白，在其余试管中加入一个试管作为空白，在其余试管中加入1.01.0mL mL 20g 20gL 2L 2，4-4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（3737士士0.50.5）恒温箱或水浴中，保温恒温箱或水浴中，保温3 3h h。3h3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管冷到室温，然后加入后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管冷到室温，然后加入 1.01.0mL 20gmL 20gL 2,4-L 2,4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置二硝基苯肼溶液，在室温中放置10101515minmin后放入冰水内。其余步后放入冰水内。其余步骤同样品。骤同样品。第51页/共58页（4 4）硫酸（）硫酸（9 91 1）处理）处理 当试管放入冰水后，向每一试管中加入当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL5mL硫酸（硫酸（9 9十十1 1）滴加时间至少需要）滴加时间至少需要1min1min，（防止溶液温度升高而使部分有机物分解着色，影响空白值），需边加边摇动试管。将防止溶液温度升高而使部分有机物分解着色，影响空白值），需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置试管自冰水中取出，在室温放置3030minmin后比色。后比色。（5 5）比色）比色 用用1cm1cm比色杯，以空白液调零点，于比色杯，以空白液调零点，于500500nmnm波长测吸光值。波长测吸光值。第52页/共58页(6)(6)标准曲线绘制标准曲线绘制加加 2g2g活性炭于活性炭于 50 50mLmL标准溶液（标准溶液（1 1mg/mLmg/mL）中，摇动中，摇动 1min1min，过滤。过滤。取取1010mLmL滤液放入滤液放入500500mLmL容量瓶中，加容量瓶中，加 5.0 5.0g g硫脲，用硫脲，用 10 10g gL L的草酸溶液稀释至刻度，抗坏的草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度血酸浓度2020ggmLmL。取取5 5、1010、2020、2525、4040、5050、6060mLmL稀释液，分别放入稀释液，分别放入7 7个个100100mLmL容量瓶中，用容量瓶中，用 10 10g/Lg/L硫硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀