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第三章第三章 DNADNA的复制的复制 复制（复制（replication）：是指以原来的）：是指以原来的DNA分子作为模板合成出相同分子的过程。分子作为模板合成出相同分子的过程。n复制在保持生物稳定性方面起重要作用；n复制是细胞分裂的前提和基础；n复制是精确的复制，一般不会差错；n复制方式为半保留复制（semiconservative replication）。第一节第一节 半保留复制的验证半保留复制的验证 半半保保留留复复制制：亲亲代代DNA的的两两条条链链解解开开，每每条条链链都都作作为为模模板板形形成成两两个个子子代代DNA分分子子；新新合合成成的的每每个个子子代代DNA分分子子中中，一一条条链链来来自自亲亲代代DNA分分子子，另一条链是新合成的。另一条链是新合成的。n半保留模型（semioconservetivemodel）n全保留复制模型(conservetivemodel)n分散模型(Dispersivemodel)验证半保留复制的实验验证半保留复制的实验nMeselson-Stahl实验实验nTaylar实验实验n姐妹染色单体差别染色方法姐妹染色单体差别染色方法nCairns复制模型复制模型型复制型复制 第二节第二节 复制的起点、方向和终点复制的起点、方向和终点 一一.研究方法：研究方法：1.用同位素标记电镜观察：用同位素标记电镜观察：1973年年R.L.Rodrigue等提出的，验证了等提出的，验证了E.coli环环状状DNA是双向复制，一个复制起点，且终点在是双向复制，一个复制起点，且终点在起点对面。起点对面。2.用噬菌体插入标记法用噬菌体插入标记法 同步培养同步培养 不同步培养不同步培养 3.变性定性法变性定性法4.双向电泳法双向电泳法 二、原核的复制起点和方向二、原核的复制起点和方向复制起点（复制起点（origin,oriorigin,ori）：）：DNADNA分子上特定的发动复制分子上特定的发动复制 的起始位点。的起始位点。复制终点（复制终点（terminusterminus）：）：DNADNA分子上复制终止的位点。分子上复制终止的位点。复制子（复制子（repliconreplicon）：从复制起点到复制终点这样一个）：从复制起点到复制终点这样一个 完整的完整的DNADNA单位称为复制子。单位称为复制子。n原原核核细细胞胞基基因因组组实实质质为为一一条条双双链链DNADNA分分子子，作作为为一一个个复复制子，整个基因组的复制起始于单一位点（起点）；制子，整个基因组的复制起始于单一位点（起点）；n真真核核细细胞胞基基因因组组庞庞大大，有有多多个个复复制制起起点点和和复复制制终终点点，含有多个复制子。含有多个复制子。复制的特点：复制的特点：nE.coli定点、双向对称复制定点、双向对称复制;nT7（噬菌体）在近一端的（噬菌体）在近一端的17处开始，向两端延伸处开始，向两端延伸;n枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制;一一侧侧复复制制基基因因组组的的4/5，另另一一侧侧只只复复制制1/5，终终点点也也不不在在Ori的对面。的对面。n质质粒粒R6K早早期期为为单单向向复复制制，复复制制了了约约1/5基基因因组组时时进进行行双向复制双向复制;n质粒质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制有固定起始点，但却为单向复制;nmt（线粒体）（线粒体）DNA进行进行D（displaced loop）环复制。）环复制。8D-环环复复制制时时需需合合成成引引物物。mtDNA为为双双链链，第第一一个个引引物物以以内内环环为为模模板板延延伸伸。至至第第二二个个复复制制起起始始点点时时，又又合合成成另另一一个个反反向向引引物物，以以外外环环为为模模板板进进行行反反向向的的延延伸伸。最最后后完完成成两两个个双双链链环环状状DNA的的复复制制。复复制制中中呈字母呈字母D形状而得名。形状而得名。dNTPDNA-pol n复制过程复制过程n在研究真核细胞内在研究真核细胞内线粒体线粒体DNA的复制时，发现了的复制时，发现了DNA的的D环复制。复环复制。复制过程四阶段。制过程四阶段。D环复制的特点是两条链的复制不是同步的。环复制的特点是两条链的复制不是同步的。n1.H链首先合成：在复制起点处以链首先合成：在复制起点处以H链为模板，合成链为模板，合成RNA引物，然引物，然后由后由DNA聚合酶聚合酶催化合成一个催化合成一个500-600bp长的长的H链片段。该片段与链片段。该片段与H链以氢键结合，将亲代的链以氢键结合，将亲代的L链置换出来，产生链置换出来，产生D环复制中间物。新的环复制中间物。新的H链链DNA片段由于分子片段由于分子3端终止的位置不定而长短不一端终止的位置不定而长短不一;也有一些也有一些3端端位置是固定的，而由于位置是固定的，而由于5端被降解而使整个端被降解而使整个DNA片段长短不一。合成片段长短不一。合成这样这样500-600bp长的长的DNA片段不会引起线粒体片段不会引起线粒体DNA超螺旋结构的明超螺旋结构的明显改变。显改变。n2.H链片段的继续合成：上述产生的链片段的继续合成：上述产生的H链片段由于太短而很容易被挤链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体出去恢复线粒体DNA完整的双螺旋结构。但有时这个片段会继续合成，完整的双螺旋结构。但有时这个片段会继续合成，这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开。这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开。n3.L链合成开始：以被置换下来的亲代链合成开始：以被置换下来的亲代L链为模板，离链为模板，离H链合成起点链合成起点60%基因组的位置开始合成基因组的位置开始合成L链链DNA，合成也需要，合成也需要RNA引物。引物。n4.复制的完成：复制的完成：H链的合成提前完成，链的合成提前完成，L链的合成随后结束。线粒体链的合成随后结束。线粒体DNA合成速度相当缓慢，约每秒合成速度相当缓慢，约每秒10个核苷酸，整个复制过程需要个核苷酸，整个复制过程需要1个个小时。刚刚合成的线粒体小时。刚刚合成的线粒体DNA是松弛型的，需要是松弛型的，需要40分钟将其变成超分钟将其变成超螺旋型螺旋型n考察基因功能的常用方法-突变体的表型变化突变型可分为二类：一类为可以补偿的；另一类为不可补偿的；n考察复制有关酶的常用突变型-温度敏感突变体 此突变体属于条件致死突变型，即：在25正常生长，42不能生长致死。第三节第三节 原核生物复制的酶系统原核生物复制的酶系统n利用大肠杆菌利用大肠杆菌温度敏感突变体温度敏感突变体研究与复制有关基因研究与复制有关基因(dna)一般复制的过程包括：起始、延伸和终止一般复制的过程包括：起始、延伸和终止3个阶段。每一阶段的蛋白质个阶段。每一阶段的蛋白质和酶不完全相同，可利用如下和酶不完全相同，可利用如下2种突变体来筛选。种突变体来筛选。快停突变体快停突变体：温度升高：温度升高(42-45)，复制立即停止。缺失复制体组分的，复制立即停止。缺失复制体组分的 酶，特别是延伸的酶或参与供应关键前体的酶。酶，特别是延伸的酶或参与供应关键前体的酶。dna突变体突变体 慢停突变体慢停突变体：在非允许温度下：在非允许温度下(42-45)，可以完成当前的复制，但不，可以完成当前的复制，但不 能开始新的复制。缺失复制起始有关的酶。能开始新的复制。缺失复制起始有关的酶。一、DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol DNA DNA聚合酶的共同特点：聚合酶的共同特点：n需要提供合成模板；n不能起始新的DNA链；必须要有引物（一小段DNA或RNA）提供3-OH，在此基础上聚合添加；n合成的方向都是53（即子链是53）；n除聚合DNA外还有其它功能（如校对、修复等）。E.coli 中主要的三种DNA多聚酶DNApolDNApolDNApol结构分子量103KD90KD900KD构成单体单体异多聚体分子数/细胞400？10-20酶活性：53聚合酶+35外切酶+53外切酶+(可切单链)突变体突变位点pol Apol BpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制（一）DNA聚合酶In发现：西班牙裔美国人A.Kornberg等在1956年完成第一例体外合成DNA实验。从大肠杆菌中分离得到一种酶，此酶可以将核苷酸共价连接在一条已经存在的DNA链上，称此酶为DNA聚合酶I或Kornberg酶。15 单一肽链的大分子蛋白质，分子量约为109KD，每个细胞中大约存在400个DNA-pol (109kD)DNA聚合酶I的结构（要求）由由PolA基因编码的单个肽链，基因编码的单个肽链，MW：103KD可被枯草杆菌蛋白切成可被枯草杆菌蛋白切成2 2个片段：个片段：小片段位于小片段位于N N端端35KD 大片段位于大片段位于C C端端68KD即即Klenow片段片段DNADNA聚合酶聚合酶I I有有6 6个结合位点；个结合位点；n模板结合位点；模板结合位点；(有引物的有引物的ssDNA,ssDNA,有缺口的有缺口的dsDNA)dsDNA)n引物结合位点；引物结合位点；(引物可以是一小段引物可以是一小段DNADNA或是或是RNA)RNA)n引物引物33OHOH结合位点；结合位点；n底物底物dNTPdNTP结合位点；结合位点；n5353外切酶结合位点；（位于外切酶结合位点；（位于N N端小片段）端小片段）n3535校正位点。（靠校正位点。（靠C C端大片段偏中间部位）端大片段偏中间部位）17323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5-3核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 3-5核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol DNA聚合酶的功能（要求）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。1.53聚合功能；聚合功能；主要用于主要用于DNA的修复和后随链中的修复和后随链中RNA引物的置换。引物的置换。2.35外切活性；外切活性；主要起校正功能，切除合成中错配的碱基。主要起校正功能，切除合成中错配的碱基。3.53外切活性；外切活性；(1)切口平移切口平移（nick translation）；）；(2)链的置换链的置换；(3)模板转换模板转换（template-switching）；）；4.内切酶活性：内切酶活性：主要用于切除修复系统，正常复制中无主要用于切除修复系统，正常复制中无。19（二）（二）DNA-pol（120kD）DNA-pol 基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。（三）DNA多聚酶n发现：针对一株dnaE基因缺失突变型的研究，其在25可以正常生长合成DNA，当转移至43时，DNA的复制过程终止，这表明dnaE的表达产物是DNA合成所必需的。n证实dnaE基因的编码产物是DNA聚合酶III的亚基，其具有53聚合酶活性。21DNA pol（830kD）n功能：功能：是原核生物复制延长是原核生物复制延长中真正起催化作用的中真正起催化作用的酶。酶。22由十种亚基构成的不对称异二聚体。由十种亚基构成的不对称异二聚体。253 聚合酶聚合酶活性活性3-5外切酶活外切酶活性和碱基选择功性和碱基选择功能能维系二聚体的作用维系二聚体的作用DNA多聚酶结构组成如下图：全酶在DNA上的装配分为三个阶段n一一个个二二聚聚体体加加上上一一个个复复合合体体识识别别引引物物模模板板形形成一种前起始复合物；成一种前起始复合物；nDNA在在与与、复复合合体体结结合合的的位位点点构构象象发发生生改改变变，而而对对核核心心酶酶产产生生了了高高亲亲和和力力使使核核心心酶酶能能与与DNA结合；结合；n二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。DNA多聚酶多聚酶的功能的功能n53聚合酶功能：聚合酶功能：能催化能催化DNADNA沿沿5 53 3 方向延方向延长长对模板要求高，仅有缺口对模板要求高，仅有缺口100nt的的dsDNA才才可做模板。可做模板。n35外切酶活性：与外切酶活性：与DNA聚合酶聚合酶I相同，有校对相同，有校对功能。功能。n53外切酶活性：与外切酶活性：与DNA聚合酶聚合酶I不同，仅能以不同，仅能以单链为底物，不能进行缺口平移。单链为底物，不能进行缺口平移。DNA多聚酶多聚酶是合成是合成DNA的主角，一般合成长片段的主角，一般合成长片段如前导链和后随链冈崎片段的合成。如前导链和后随链冈崎片段的合成。26原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶27常见的真核细胞常见的真核细胞DNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。合成前导链，合成前导链，参与合成后随参与合成后随链链;/复合物复合物沿着沿着DNA模板进行子链的延伸模板进行子链的延伸DNA-pol 在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol 高保真修复，碱基切除修复高保真修复，碱基切除修复DNA-pol 在复制过程中起校读、修复和填在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。补缺口的作用。DNA-pol 二、二、DNADNA连接酶（连接酶（DNA DNA ligase）*作作用用是是连连接接DNA分分子子，将将相相邻邻的的3-OH和和5-P连连接接成磷酸二酯键，封闭缺口。成磷酸二酯键，封闭缺口。其作用过程分三步进行：其作用过程分三步进行：1.EATPEAMPppi 在在E.coli中：中：ENADEAMPNMN2.E-AMP上的上的AMP转移到转移到DNA的的5-PO4上使其活化；上使其活化；3.活化的活化的5-PO4与相邻的与相邻的3-OH作用形成作用形成35 磷酸二酯键，并释放出磷酸二酯键，并释放出AMP。*此此酶酶在在后后随随链链的的合合成成、DNA的的损损伤伤修修复复、重重组组及及转座中发挥重要的作用。转座中发挥重要的作用。29需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。未封闭的切口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；DNA连接酶的催化特点：连接酶的催化特点：30DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。一。DNADNA连接酶的作用：连接酶的作用：三、螺旋酶（三、螺旋酶（helicase）又称解旋酶，是解开氢键促进又称解旋酶，是解开氢键促进DNA的两条互补链的两条互补链分离的酶。分离的酶。n是是DNA复制、重组、修复过程中关键的发动蛋白；复制、重组、修复过程中关键的发动蛋白；n具有依赖具有依赖DNA的的ATPase活性，利用活性，利用ATP水解产生的能水解产生的能量解旋量解旋DNA并使螺旋酶沿并使螺旋酶沿DNA链移动。一般每解开一对链移动。一般每解开一对碱基需要水解一个碱基需要水解一个ATP。与产物单链与产物单链DNA结合，如螺旋酶结合，如螺旋酶，螺旋酶，螺旋酶。螺旋酶螺旋酶 仅仅催化仅仅催化DNA双链的分离，常与双链的分离，常与SSB蛋白结合蛋白结合 如如E.coli 中中rep蛋白，螺旋酶蛋白，螺旋酶。四、单链结合蛋白四、单链结合蛋白SSBSSB（single binding proteinsingle binding protein）单链结合蛋白：又称双螺旋去稳定蛋白单链结合蛋白：又称双螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing (helix destabilizing protein)protein)，可以结合单链，防止形成双链或发夹结构，可以结合单链，防止形成双链或发夹结构，同时保护单链不被核酸酶水解。同时保护单链不被核酸酶水解。n在在E.coli E.coli 中，中，SSBSSB是由是由177177个个aaaa组成的蛋白质组成的蛋白质;以四聚体存以四聚体存在在;分子量为分子量为74KDa;74KDa;结合单链结合单链DNADNA可覆盖可覆盖32nt32nt，保护，保护DNADNA。n在原核中在原核中SSBSSB与与DNADNA结合表现出协同效应（第一个结合表现出协同效应（第一个SSBSSB的结合的结合能力是能力是1 1，则第二个，则第二个SSBSSB的结合能力为的结合能力为10001000）：）：（1 1）SSBSSB之间的相互作用；之间的相互作用；（2 2）第一个）第一个SSBSSB和和DNADNA的结合改变了的结合改变了DNADNA的结构。的结构。n真核生物的复制系统中具有复制因子真核生物的复制系统中具有复制因子A A（RF-ARF-A）相当于）相当于SSBSSB，但无协同作用。但无协同作用。34DNADNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNADNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。DNA复制的拓扑性质复制的拓扑性质 五、拓扑异构酶35nDNA复制时，两条链打开，必然造成DNA分子形成缠绕、打结、连环等现象，从而产生扭曲张力。n闭环状的DNA按一定方向扭转形成超螺旋。盘绕过分称为正超螺旋，盘绕不足为负超螺旋。复制时，部分DNA要呈松弛状态。36拓扑异构酶的作用特点拓扑异构酶的作用特点:既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键*拓扑异构酶拓扑异构酶*拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类 拓扑异构酶（topoisomerase）拓扑异构酶：催化拓扑异构酶：催化DNA环的拓扑异构体之间转化的酶，它环的拓扑异构体之间转化的酶，它可以在切割可以在切割DNA的单链或双链后，催化一个的单链或双链后，催化一个 DNA分子单分子单链或双螺旋链穿过断裂的单（双）链再重新闭合。链或双螺旋链穿过断裂的单（双）链再重新闭合。37拓扑异拓扑异构酶构酶I I切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反反应应不需不需ATP。如大肠杆菌如大肠杆菌DNA拓拓扑异构酶扑异构酶。拓扑异构拓扑异构酶酶II II无无ATP时，切断时，切断DNA分子分子两股两股链，链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能时，使松弛供能时，使松弛DNA分子分子进入负超螺旋状态，连接断端。进入负超螺旋状态，连接断端。如如大肠杆菌的大肠杆菌的DNA旋转酶旋转酶(gyrase)又又称称DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶。DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 38小结：小结：参与参与DNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质 主要成员主要成员功功 能能DnaA DnaA 识别复制起始位识别复制起始位点点解螺旋酶解螺旋酶 解开解开DNA双链双链SSB 维持已解开单链维持已解开单链DNA的稳定的稳定引物酶引物酶 合成合成RNA引物引物 拓扑异构酶拓扑异构酶 使打结、缠绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰松驰DNA-pol DNA复制延长中起主要作用复制延长中起主要作用DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接第四节 原核生物和病毒的复制p原核细胞染色体原核细胞染色体DNADNA的复制起始于固定位点，双向复制；的复制起始于固定位点，双向复制；p噬菌体、病毒核酸的复制可以起始于不同位点，双向或噬菌体、病毒核酸的复制可以起始于不同位点，双向或单向复制，也可以采取特殊的复制方式，如单向复制，也可以采取特殊的复制方式，如滚环复制滚环复制。n大肠杆菌大肠杆菌-环状环状DNADNA分子分子nF F质粒质粒(F(F因子因子)-)-环状环状DNADNA分子分子n噬菌体噬菌体-有环状有环状DNADNA分子也有线状分子也有线状DNADNAn腺病毒腺病毒-线状线状DNADNA分子分子40 DNA DNA复制时，在复制时，在复制时，在复制时，在DNADNA合成的复制叉上，分布有合成的复制叉上，分布有合成的复制叉上，分布有合成的复制叉上，分布有各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为合物称为合物称为合物称为复制体。复制体。复制体。复制体。Dna A Dna B Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物酶引物酶SSB3535 复制体结构的变化形成复制的不同阶段。大肠杆复制体结构的变化形成复制的不同阶段。大肠杆复制体结构的变化形成复制的不同阶段。大肠杆复制体结构的变化形成复制的不同阶段。大肠杆菌菌菌菌DNADNA的复制分为三个阶段：的复制分为三个阶段：的复制分为三个阶段：的复制分为三个阶段：起始起始起始起始、延伸延伸延伸延伸和和和和终止终止终止终止。一、一、大肠杆菌环状大肠杆菌环状DNA复制的过程复制的过程41需要解决两个问题：需要解决两个问题：1 1.DNADNA解开成单链，提供模板解开成单链，提供模板2.2.合成引物，提供合成引物，提供3 3-OH-OH末端末端（一）起始阶段（一）起始阶段421解旋解链，形成复制叉解旋解链，形成复制叉复制起始位点复制起始位点oriCoriC的结构特点的结构特点:E.coli的复制起点跨度为245bp包括包括3组组13bp串联重复序列串联重复序列和和2对对9bp反向重复序列反向重复序列作为作为蛋白结合位点；蛋白结合位点；富含富含AT，这可能和双链易，这可能和双链易于解开起始复制有关；于解开起始复制有关；44DnaA蛋白识别并结合到复制起始位点（ori）的9bp重复序列。20402040个个DnaA蛋白各带一个ATP相互靠近与DNA形成类似核小体的结构。串联重复序列串联重复序列 （识别区）识别区）反向重复序列反向重复序列9bp9bp重复序列重复序列5353解旋解链：解旋解链：45形成的复合物促使邻近的形成的复合物促使邻近的3 3个串联重复序列解链。个串联重复序列解链。解螺旋酶（解螺旋酶（helicasehelicase,DnaBDnaB）六聚体在）六聚体在DnaCDnaC蛋白蛋白协同下，结合到开链的中间复合物上，解开双链，协同下，结合到开链的中间复合物上，解开双链，形成两条单链形成两条单链DNADNA，并逐步置换出，并逐步置换出DnaADnaA蛋白。蛋白。单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白（SSBSSB）四聚体）四聚体结合在两条单结合在两条单链链DNADNA上，使复制叉保持适当长度。上，使复制叉保持适当长度。47含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome)。2引发体组装和引物合成：引发体组装和引物合成：Dna A Dna B Dna C引物酶引物酶SSB353548引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNADNA为模板，合成一为模板，合成一段段短短RNARNA片段片段，从而获得，从而获得33端自由羟基（端自由羟基（3-OH3-OH）。）。3 OH53535引物引物引物引物酶酶DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 Dna B Dna CSSB 解链是一个高速的反向旋转，解链是一个高速的反向旋转，其下游势必发生打结现象，因而其下游势必发生打结现象，因而需要需要DNADNA拓扑异构酶参与。拓扑异构酶参与。50n复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。n在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶。（二）复制的延长过程：领头链连续复制，（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制随从链不连续复制 *半不连续复制：在半不连续复制：在DNA的双向复制中，其中的双向复制中，其中先导链先导链是沿是沿着复制叉进行延伸，为连续复制，着复制叉进行延伸，为连续复制，后滞链后滞链是逆复制叉方向是逆复制叉方向进行不连续复制，每次合成的进行不连续复制，每次合成的DNA为一个岗崎片段（约为一个岗崎片段（约1000-2000nt），），DNA的这种复制方式称为半不连续复的这种复制方式称为半不连续复制。制。nDNA的复制方向为的复制方向为5-3；n岗崎片段的大小约为岗崎片段的大小约为1000nt，每个岗崎片段的合成都包，每个岗崎片段的合成都包括新一轮的起始发动的过程；括新一轮的起始发动的过程；n岗崎片段间的缺口由岗崎片段间的缺口由DNA聚合酶聚合酶催化填充；催化填充；nDNA连接酶连接间断点连接酶连接间断点DNA，形成完整的，形成完整的DNA链。链。后随链的合成过程后随链的合成过程p不连续复制模型：不连续复制模型：1968年日本的冈崎等提出，做了年日本的冈崎等提出，做了2个实验（脉冲标记实个实验（脉冲标记实验和脉冲追踪实验）验证，复制出的验和脉冲追踪实验）验证，复制出的DNA片段长约片段长约1000-2000nt。p半不连续复制模型：半不连续复制模型：1978年年B.M.Olivera提出，前导链的合成是连续的，后提出，前导链的合成是连续的，后随链的合成是不连续的。片段的形成是因为随链的合成是不连续的。片段的形成是因为DNA中中U的混的混入，被尿嘧啶入，被尿嘧啶N-糖苷酶切断所致。糖苷酶切断所致。p复制体和回环模型：复制体和回环模型：复制体：由解旋酶、引发酶和复制体：由解旋酶、引发酶和DNA聚合酶聚合酶III全酶组成的全酶组成的复合体，在复合体，在DNA合成中沿着复制叉的方向推进。合成中沿着复制叉的方向推进。回环模型：复制体中，后随链模板形成一个回环，使环中回环模型：复制体中，后随链模板形成一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制。双链在同一复制体上进行复制。后随链的合成过程后随链的合成过程53催化领头链和随从链是在同一催化领头链和随从链是在同一DNA聚合酶聚合酶的催化下延长的的催化下延长的pPol为不对称二聚体，为不对称二聚体，一个作用于前导链，另一个一个作用于前导链，另一个作用于随从链作用于随从链(loop)。p在在DNA聚合酶聚合酶的作用下，的作用下，领头链领头链合成合成1000-2000个核个核苷酸后，苷酸后，随从链随从链开始合成，开始合成，岗崎片段的长度岗崎片段的长度 为为1000-2000个（大肠杆菌）个（大肠杆菌）54原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli72321.1.去除去除去除去除RNARNA引物引物引物引物,填补缺口填补缺口填补缺口填补缺口2.2.把把把把DNADNA连接成完整的子链连接成完整的子链连接成完整的子链连接成完整的子链 终止的任务包括终止的任务包括:（三）复制的终止过程：切除引物、填（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口补空缺、连接切口 E.coli的复制终止的复制终止n现已发现有两对终止区域（terE,D,AterE,D,A和ter ter C,BC,B）位于相遇点的两侧约100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的；nter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性；n终止需要tustus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)，Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进；nter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来封闭复制叉的通路实行终止。56n在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；nRNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。1.去除引物，填补缺口：去除引物，填补缺口：57n在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。2.连接冈崎片段：连接冈崎片段：581.复制起始复制起始：解链过程：解链过程：DnaA、DnaB（解螺旋解螺旋酶）、酶）、DnaC 引物酶加入引物酶加入，形成形成引发体引发体，合成引物。，合成引物。拓扑酶拓扑酶、SSB的参与。的参与。2.2.复制延长：复制延长：DNA-pol起主要作用；起主要作用；子链延长方向子链延长方向53；领头链连续复制，随从链形成冈崎片段。领头链连续复制，随从链形成冈崎片段。3.3.复制终止复制终止：RNA酶酶水解引物；水解引物；空缺由空缺由DNA-pol催化合成催化合成DNA填补；填补；DNA连接酶连接酶连成完整的子链连成完整的子链等等。原核生物复制小结：原核生物复制小结：二、滚环复制二、滚环复制（rolling circle replication）滚环复制：是小分子量的环状滚环复制：是小分子量的环状DNA分子所采取一种特殊复制形式。分子所采取一种特殊复制形式。在滚环复制中，先导链借助模板环的滚动复制产生环状分子拷贝。在滚环复制中，先导链借助模板环的滚动复制产生环状分子拷贝。1968年年Gilbert 提出提出滚环复制模型滚环复制模型:（1）一条链断裂，产生）一条链断裂，产生 自由自由3OH 末端；末端；（2）只有一个复制叉）只有一个复制叉;（3）不需）不需RNA引物，在正链引物，在正链3OH上延伸；上延伸；（4）可形成多联体（）可形成多联体（concatemer）;（5）模板链和新合成的链分开）模板链和新合成的链分开;进行滚环复制的DNA分子类型：n真核真核rDNA的扩增的扩增；n细菌细菌F因子因子DNA的转移的转移；n噬菌体噬菌体裂解途经的复制裂解途经的复制；nX174、M13、G4等病毒的复制；等病毒的复制；如：如：X174为单链环状为单链环状DNA噬菌体噬菌体，为单正，为单正+链，链，其复制第一步是合成一条互补的负其复制第一步是合成一条互补的负-链产生双链产生双链环；第二阶段复制进行滚环复制。链环；第二阶段复制进行滚环复制。三、线状DNA复制起始及末端补齐u线线性性双双链链DNA的的复复制制有有的的是是从从一一端端开开始始的的，称称为为末末端端起起始始复复制制。如如腺腺病病毒毒（Adenovirus）、29 DNAs、脊髓灰质病毒（、脊髓灰质病毒（poliovirus)。腺病毒腺病毒DNA全长全长35937 bp,线性双链；线性双链；两两端端各各有有反反向向重重复复顺顺序序103162bp，两两末末端端各各有有50bp为复制起点；为复制起点；其其复复制制是是以以单单链链置置换换（strand displacement）形形成成一一个个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。大的茎环或叫平锅形结构来进行的。u线性双链线性双链DNA复制的末端补齐：复制的末端补齐：腺病毒利用末端蛋白代替腺病毒利用末端蛋白代替RNA引物；引物；真核生物染色体的末端依赖端粒酶的特殊功能；真核生物染色体的末端依赖端粒酶的特殊功能；第五节 真核细胞DNA的复制n真核细胞中染色体真核细胞中染色体DNA的复制是通过许多独立的复制子（复制元）来的复制是通过许多独立的复制子（复制元）来完成的，每个复制子都有固定的复制起点，采用双向复制；完成的，每个复制子都有固定的复制起点，采用双向复制；n染色体染色体DNA为线性分子，各复制子不一定同时活化，但在细胞的一个为线性分子，各复制子不一定同时活化，但在细胞的一个分裂周期内只能复制一次；分裂周期内只能复制一次；n复制的调控机制尚不清楚；复制的调控机制尚不清楚；n对真核细胞对真核细胞DNA的复制研究常以感染宿主细胞的病毒（的复制研究常以感染宿主细胞的病毒（SV40）复制）复制为基础，因为两者的复制有相似之处。为基础，因为两者的复制有相似之处。65（一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似n真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动。n复制起始点比原核生物短，富含AT，称为自主复制序列（ARS，autonomous replication sequence）。66多多起点、起点、双双方向方向真核生物：真核生物：从起点开始，以双向等速进行，一个从起点开始，以双向等速进行，一个DNADNA分子上有许多个特定的复制起点。分子上有许多个特定的复制起点。67真核生物所含的真核生物所含的DNA聚合酶种类更多：聚合酶种类更多：真核生物真核生物DNA pol DNA pol 已发现有已发现有已发现有已发现有5 5种，分别命名为：种，分别命名为：种，分别命名为：种，分别命名为：DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 ,应急修复。应急修复。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 68n增殖细胞核抗原(PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。69（二）真核生物复制的延长发生（二）真核生物复制的延长发生 DNA聚合酶聚合酶/转换转换nDNA-pol 引物酶活性，催化合成引物；nDNA-pol 解螺旋酶活性，催化合成子链 引物合成后，DNA-pol 在PCNA的协同下将DNA-pol置换出，然后催化合成子链。n冈崎片段长度约为n135bp(一个核小体所含DNA的量)n随从链合成过程中DNA-pol与DNA-pol 之间的转换频率大。703553领头链领头链3535亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体n真核生物复制叉的延长：真核生物复制叉的延长：领头链的连续复制也只限于领头链的连续复制也只限于半个复制子半个复制子的长度的长度71（三）复制的终止（三）复制的终止端粒酶参与解决染色体末端复制问题端粒酶参与解决染色体末端复制问题1.去除引物去除引物RNA酶、酶、DNA酶酶2.把把DNA连接成完整的子链连接成完整的子链复制终止阶段需：复制终止阶段需：72I.复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接(与原核生物类似与原核生物类似)II.染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。(与原核生物不同与原核生物不同)73真核生物染色体真核生物染色体DNADNA是线形结构。是线形结构。线性线性DNADNA在复制在复制完成后，其末端由完成后，其末端由于引物于引物RNARNA的水解的水解可能出现缩短可能出现缩短。74n端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。真核生物通过真核生物通过端粒的特殊复制方式端粒的特殊复制方式来解决复制中来解决复制中DNA逐渐变短的问题逐渐变短的问题75功功 能能