《生化实验技术》综合设计性大实验.ppt

生化实验技术生化实验技术综合设计性大实验综合设计性大实验合作性学习实验实施流程及要求合作性学习实验实施流程及要求l课堂理论学习：课堂理论学习：辅导相关生化大分子提取分离辅导相关生化大分子提取分离纯化基本知识纯化基本知识l项目发布：项目发布：了解项目内容了解项目内容l网上预约：网上预约：理论自学理论自学设计实验方案设计实验方案网网上递交上递交教师修改及审核教师修改及审核实验室项目实实验室项目实施施论文上交论文上交教师批阅教师批阅评分评分l实验分组：实验分组：各自组合，最多不超过各自组合，最多不超过4 4人人/组，推组，推选组长，负责平时讨论、项目方案设计及材料选组长，负责平时讨论、项目方案设计及材料收集收集l实验实施要求实验实施要求：平时按各组计划时间分：平时按各组计划时间分别进行实验，组长有义务指导下组相关别进行实验，组长有义务指导下组相关实验内容，每次实验必须登记。实验内容，每次实验必须登记。l全班交流全班交流：实验结束安排课堂讨论交流，：实验结束安排课堂讨论交流，每组准备一人汇报，一人记录；要求用每组准备一人汇报，一人记录；要求用PPTPPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难总结汇报项目实施、实验创新、疑难点，其他组学生质疑，教师点评。点，其他组学生质疑，教师点评。l指导教师指导教师：汪财生、斯越秀：汪财生、斯越秀l通过综合训练，能够系统掌握蛋白质、通过综合训练，能够系统掌握蛋白质、DNA制备的基本原理和操作，学习如何制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的环节，对实验中出现的问题进行科学的分析；在学习实验技术的同时，自觉培分析；在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。养分析问题和解决问题能力。实验项目训练目标实验项目训练目标思考题（课前设疑）思考题（课前设疑）1.1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物如何保持生化物质的生物活性？一般生化物质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件下容易变性？下容易变性？2.2.一般从天然生物材料制作生化物质的过程大一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段？体可分为几个阶段？3.3.在制备生化物质前应如何选择原料？在制备生化物质前应如何选择原料？4.4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用上有何区别？上有何区别？5.5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进行对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？进行？6.6.以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的基本原理？基本原理？7.7.干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓离子交换剂转型？离子交换剂转型？8.8.动植物总动植物总DNADNA或或RNARNA提取的方法主要有哪提取的方法主要有哪些？以猪脾脏些？以猪脾脏DNADNA提取为例试述每步骤主提取为例试述每步骤主要原理是什么？如何判断所提取要原理是什么？如何判断所提取DNADNA的纯的纯度？度？9.9.蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量测定方法有哪些？测定方法有哪些？0707级生物技术实验安排级生物技术实验安排l11-1411-14周周 生物技术生物技术072-073072-073班实验班实验l14-1614-16周周 生物技术生物技术071071班实验班实验l1515周周 生物技术生物技术072-073072-073班上交班上交 论文及讨论材料等论文及讨论材料等l1717周周 生物技术生物技术071071班上交论文班上交论文 及讨论材料等及讨论材料等第一部分第一部分 生化物质的制备分析生化物质的制备分析 一般从天然生物材料制作生化物质一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段：的过程大体可分为六个阶段：1.1.原料的选择和预处理原料的选择和预处理 2.2.原料的粉碎；原料的粉碎；3.3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗 品的工艺过程；品的工艺过程；4.4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行 精制的工艺过程；精制的工艺过程；利利用用生生化化制制备备技技术术从从生生物物材材料料中中获获得得特特殊殊的的生生物物活活性性物物质质，如如蛋蛋白白质质、酶酶、激激素素、核核酸酸等等生生化化产产品品时时，通通常常要要注注意意以下几个问题：以下几个问题：6.6.成成品品及及制制剂剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。5.5.干燥及保存干燥及保存；1 1生生物物材材料料的的组组成成成成分分非非常常复复杂杂，有有数数百百种种甚甚至至更更多多，各各种种化化合合物物的的形形状状、大大小小、相相对对分分子子质质量量和和理理化化性性质质都都各各不不相相同同，有有的的迄迄今今还还是是未未知知物物，而而且且这这些些化化合合物物在在分分离离时时仍仍在在不不断断的的代谢变化中。代谢变化中。2 2在生物材料中，有些化合物含量很低在生物材料中，有些化合物含量很低或极微，有的只有或极微，有的只有1 1l0 000l0 000，甚至更少。制，甚至更少。制备时，原材料用量很大，得到产品很少，与备时，原材料用量很大，得到产品很少，与投料量相比投料量相比“虎头蛇尾虎头蛇尾”。近年来，用所谓。近年来，用所谓“钓鱼法钓鱼法”，利用某些分子特有的专一亲和，利用某些分子特有的专一亲和力，将某一化合物从极复杂的体系中力，将某一化合物从极复杂的体系中“钓钓”出来，与其他化学分离技术相比具有很大的出来，与其他化学分离技术相比具有很大的优越性。优越性。3 3许许多多生生物物活活性性物物质质，一一旦旦离离开开了了生生物物体体内内环环境境，很很易易变变性性及及被被破破坏坏，应应十十分分注注意意保保护护这这些些化化合合物物生生物物的的活活性性，常常选选择择十十分分温温和和的的条条件件，尽尽可可能能在在较较低低温温度度和和洁洁净净环环境境中中进进行行。一一般般来来说说制制备备的的操操作作时时间间长长、手手续续较较繁繁琐琐。因因为为许许多多大大分分子子在在分分离离过过程程中中，过过酸酸、过过碱碱、重重金金属属离离子子、高高温温、剧剧烈烈的的机机械械作作用用、强强烈烈的的辐辐射射和和机机体体内内自自身身酶酶的的作作用用，均均可可破破坏坏这这些些分分子子的结构或生理活性。的结构或生理活性。4 4生生化化分分离离制制备备过过程程几几乎乎都都在在溶溶液液中中进进行行，各各种种温温度度、pHpH、离离子子强强度度等等参参数数，对对溶溶液液中中各各种种组组成成的的综综合合影影响响，常常常常无无法法固固定定，有有些些实实验验或或工工艺艺的的设设计计理理论论性性不不强强，常常带带有有很很大大的的经经验验成成分分。因因此此，要要建建立立重重复复性性好好的的成成熟熟工工艺艺，对对生生物物材材料料、各各种种试试剂剂及及其其辅辅助助材料等都要严格地加以规定。材料等都要严格地加以规定。5 5生化制备方法最后生化制备方法最后均一性均一性的证明的证明与化学上与化学上纯度纯度的概念并不完全相同，这的概念并不完全相同，这是由于生物分子对环境反应十分敏感，是由于生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能的关系比较复杂，评定其均结构与功能的关系比较复杂，评定其均一性时，要通过不同角度测定，才能得一性时，要通过不同角度测定，才能得出相对出相对“均一性均一性”结论，只凭一种方法结论，只凭一种方法所得纯度的结论，往往是片面的，甚至所得纯度的结论，往往是片面的，甚至是错误的。是错误的。原料选择和预处理原料选择和预处理 选什么样的原材料应视生产目的而定。选什么样的原材料应视生产目的而定。一般要注意以下几个方面一般要注意以下几个方面:1 1要选择有效成分含量高的新鲜材料；要选择有效成分含量高的新鲜材料；2 2来源丰富易得；来源丰富易得；3 3制造工艺简单易行；制造工艺简单易行；4 4成本比较低；成本比较低；5 5经济效果要好。经济效果要好。如蛋白质原料的选择如蛋白质原料的选择 蛋蛋白白质质类类生生化化产产品品的的原原料料来来源源有有动动植植物物组组织织和和微微生生物物等等，原原则则是是要要选选择择富富含含所所需需蛋蛋白白质质多多肽肽成成分分的的、易易于于获获得得和和易易于于提提取的无害生物材料。取的无害生物材料。对天然蛋白质生化产品，为提高其质量、对天然蛋白质生化产品，为提高其质量、产量和降低生产成本，对原料的产量和降低生产成本，对原料的种属、种属、发育发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，了都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之则收效甚微。则收效甚微。1 1种属种属 牛牛胰胰含含胰胰岛岛素素（insulin)insulin)单单位位比比猪猪胰胰高高，牛牛为为4000 4000 IUIUkgkg胰胰脏脏，猪猪为为3000 3000 IUIUkgkg胰胰脏脏。抗抗原原性性则则猪猪胰胰岛岛素素比比牛牛胰胰岛岛素素低低，前前者者与与人人胰胰岛岛素素相相比比，只只有有1 1个个氨氨基基酸酸的的差差异异，而而牛牛有有3 3个个氨氨基基酸的差异。酸的差异。2 2发育生长阶段发育生长阶段 幼幼年年动动物物的的胸胸腺腺比比较较发发达达，老老龄龄后后逐逐渐渐萎萎缩缩，因因此此胸胸腺腺原原料料必必须须采采自自幼龄动物。幼龄动物。3 3生物状态生物状态 动动物物饱饱食食后后宰宰杀杀，胰胰脏脏中中的的胰胰岛岛素素含含量量增增加加，对对提提取取胰胰岛岛素素有有利利，但但胆胆囊囊收收缩缩素素的的分分泌泌使使胆胆汁汁排排空空，对对胆胆汁汁的的收收集集不不利利。严严重重再再生生障障碍碍性性贫贫血血症症患患者者尿尿中中的的EPOEPO（erythropoietin,erythropoietin,红细胞生成素）含量增加。红细胞生成素）含量增加。4 4原料来源原料来源 血管舒缓素可分别从血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪猪胰脏和猪颚下腺颚下腺中提取，两者生物学功能并无中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。因其不含蛋白水解酶。5 5原料解剖学部位原料解剖学部位 猪猪胰胰脏脏中中，胰胰尾尾部部分分含含激激素素较较多多，而而胰胰头头部部分分含含消消化化酶酶较较多多。如如分分别别摘摘取取则则可可提提高高各产品的收率。各产品的收率。胃胃膜膜素素以以采采取取全全胃胃粘粘膜膜为为好好，胃胃蛋蛋白白酶酶则则以以采采取取胃胃底底部部粘粘膜膜为为好好，因因胃胃底底部部粘粘膜膜富富含消化酶。含消化酶。6.6.从简化提纯步骤着手从简化提纯步骤着手 如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。简化纯化步骤。7 7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用胞也应考虑到后处理的问题。如用大肠杆大肠杆菌菌表达，由于其不能将所表达的蛋白质分表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子；子；用用肿肿瘤瘤细细胞胞作作宿宿主主细细胞胞制制成成的的生生化化产产品品还还应应考考虑虑到到其其安安全全性性，制制造造体体外外诊诊断断用用试剂则是很好的高产方法。试剂则是很好的高产方法。用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷；用化等翻译及修饰的缺陷；用动物细胞和昆虫动物细胞和昆虫细胞细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。达的问题。原料的粉碎原料的粉碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生物适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生物活性物质充分释放到溶液中，有利于提取活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。或吸附。不同的生物体或同一生物体不同的组不同的生物体或同一生物体不同的组织，其破碎的难易不一样，使用的方法织，其破碎的难易不一样，使用的方法也不完全相同。动物的脏器组织，常用也不完全相同。动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以磨碎；许多微生物均具有坚韧的细胞壁，磨碎；许多微生物均具有坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。波、加压处理等破碎方法。如果提取的有效成分是体液或细菌胞如果提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎细胞。细胞。主主要要通通过过机机械械力力的的作作用用，使使组组织织粉粉碎碎。粉粉碎碎少少量量原原料料时时，可可使使用用高高速速组组织织捣捣碎碎机机（10 10 000r000rminmin）、匀匀浆浆器器、研研钵钵、研研船船等等。工工业业生生产产上上一一般般常常用用的的粉粉碎碎设设备备有有电电磨磨机机、球球磨磨机机、万万能能粉粉碎碎机机、绞绞肉机、击碎机等。肉机、击碎机等。(一一)机械法机械法 (二二)物理法物理法1.1.反复冻融法反复冻融法 把待破碎的样品冷至把待破碎的样品冷至15152020，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破碎。可以破碎。在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在水中，在9090左右维持数分钟，立即左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。分细胞被破坏。2.2.冷热交替法冷热交替法 3 3超声波处理法超声波处理法 多用于微生物材料，处理的效果与样品多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用酶时，常用5050100mg100mgL L菌体的浓度，在菌体的浓度，在1KHz1KHz10KHz10KHz（千赫兹）频率下处理（千赫兹）频率下处理101015min15min。对于其他细菌，则视具体情况而定。对于其他细菌，则视具体情况而定。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。4.4.压破碎法压破碎法 加加气气压压或或水水压压（如如上上海海高高压压匀匀浆浆泵泵厂厂生产的高压匀质机），达生产的高压匀质机），达20.5920.593434.32MPa.32MPa（210210350kgf350kgfcmcm2 2）的的压压力力时时，可可使使90%90%以以上上细细胞胞被被压压碎碎。多多用用于于微微生生物物酶酶制制剂剂的的工业制备。工业制备。(三三)生化及化学法生化及化学法 1 1自溶法自溶法 即即新新鲜鲜的的生生物物材材料料存存放放在在一一定定的的pHpH和和适适当当温温度度下下，利利用用组组织织细细胞胞中中自自身身的的酶酶系系将将细细胞胞破破坏坏，使使细细胞胞内内含含物物释释放放出出来来的的方方法法。自自溶溶的的温温度度，动动物物材材料料选选在在0 044，微生物材料则多在室温下进行，微生物材料则多在室温下进行。自自溶溶时时，需需加加少少量量的的防防腐腐剂剂，如如甲甲苯苯、氯氯仿仿等等，以以防防止止外外界界细细菌菌的的污污染染。因因自自溶溶的的时时间间较较长长，不不易易控控制制，故故制制造造具具有有活活性性的的核核酸酸、蛋蛋白白质质时时比比较少用。较少用。2 2酶处理法酶处理法 用外来酶处理生物材料，如用外来酶处理生物材料，如溶菌酶溶菌酶（LysozymeLysozyme）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNADNA时，采用时，采用pH8pH8的的0.1mol0.1molL L三羟甲基氨基甲烷（三羟甲基氨基甲烷（TrisTris）0.01mol0.01molL L乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）制成每毫升含）制成每毫升含2 2亿个细胞的细亿个细胞的细胞悬液，然后加入胞悬液，然后加入100g 1mg100g 1mg的溶菌酶，在的溶菌酶，在3737保温保温10min10min，细菌胞壁即被破坏；还有把，细菌胞壁即被破坏；还有把蜗牛酶蜗牛酶用于用于酵母细胞的破碎；用酵母细胞的破碎；用胰酶胰酶处理猪脑制备脑安素。用处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解细胞壁的酶还有于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶纤维素酶（破坏植物（破坏植物细胞）、细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。3.3.表面活性剂处理法表面活性剂处理法 表面活性剂的分子中，兼有亲脂表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有常用的有十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)、氯、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。生化物质的提取生化物质的提取 利利用用一一种种溶溶剂剂对对不不同同物物质质溶溶解解度度的的差差异异，从从混混合合物物中中分分离离出出一一种种或或几几种种组组分分的的过过程程称称为为提提取取（extractionextraction），提提取取又又称称萃萃取取或或抽抽提提，其其含含义义基基本本相相同同。用用冷冷溶溶剂剂从从固固体体态态物物质质提提取取的的过过程程可可称称为为浸浸渍渍（macerationmaceration）；用用热热溶溶剂剂者者可可称称为为浸浸提提（digestiondigestion），也也称浸煮称浸煮 一、物质的性质与提取一、物质的性质与提取（一）物质的性质与提取方法的选择（一）物质的性质与提取方法的选择 选择合适的溶剂系统与提取条件。选择合适的溶剂系统与提取条件。（二）活性物质的保护措施二）活性物质的保护措施1 1采用缓冲系统采用缓冲系统2 2添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等）添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等）3 3抑制水解酶的作用抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)(SDS,EDTA)4 4其他保护措施其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌避免过酸过碱和剧烈搅拌 ）（三）生化物质的提取（三）生化物质的提取 一一般般生生产产上上多多用用2 23 3次次提提取取。溶溶剂剂用用量量（L L）为为生生物物材材料料的的2 25 5倍倍，少少数数情情况况也也有有用用10102020倍倍量量溶溶剂剂作作一一次次性性提提取取。目目的的是是节省提取时间，降低有害酶的作用。节省提取时间，降低有害酶的作用。二、影响提取的因素二、影响提取的因素 （）温度（）温度（二）酸碱度（二）酸碱度（三）盐浓度（三）盐浓度 三、提取方法三、提取方法 （一）用酸、碱、盐水溶液提取（一）用酸、碱、盐水溶液提取（二）用表面活性剂提取（二）用表面活性剂提取（三）有机溶剂提取（三）有机溶剂提取 对对酸性酸性物质的提取，常在物质的提取，常在碱性碱性条条件下进行；对件下进行；对碱性碱性物质的提取，常在物质的提取，常在酸性酸性条件下进行；对条件下进行；对两性两性物质的提取，物质的提取，则使水溶液的则使水溶液的pHpH值在远离该两性物质值在远离该两性物质的的等电点等电点为佳。为佳。（三）超临界气体的萃取技术（三）超临界气体的萃取技术 以气体为萃取剂，当气体处于超过临以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。具有良好的溶剂性质。气体萃取剂必须具有临界压力低，临气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。主要有易得等特点。主要有二氧化碳、氮气、乙二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂与被萃取物。与被萃取物。该该技技术术应应用用于于酶酶、不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸的的提提取取（如如鱼鱼油油和和卵卵磷磷脂脂的的提提取取）、精精制制和和回回收收，也也可可用用于于生生化化产产品品的的溶溶剂剂脱脱除除。某某些些生生化化产产品品在在生生产产过过程程中中，采采用用了了丙丙酮酮和和甲甲醇醇溶溶剂剂，欲欲脱脱去去溶溶剂剂又又要要避避免免产产品品的的分分解解，需需选选择择超超临临界界气气体体提提取取。与与减减压压干干燥燥法法相相比比较较，前前者者不不多多消消耗耗能能源源，且缩短脱溶时间。且缩短脱溶时间。四、提取液的分离四、提取液的分离 提提取取所所得得到到的的溶溶液液，需需与与固固体体或或另另一一液液体体分分离离。溶溶液液与与固固体体的的分分离离，一一般般处处理理方方法法有有三三种种：自自然然沉沉降、过滤、离心降、过滤、离心。自自然然沉沉降降是是在在液液体体介介质质中中，固固体体自自然然下下沉沉而而分分离离的的过过程程。当当混混悬悬液液处处理理量量较较大大，且且固固体体和和液液体体的的比比重重悬悬殊殊时时，可可用用此此法法。沉沉降降分分层层后后，可可用用虹虹吸吸等等方法将液体部分移去。方法将液体部分移去。过过滤滤系系利利用用多多孔孔材材料料阻阻留留固固体体，而而使使液液体体通通过，达到固体与液体分离的过程过，达到固体与液体分离的过程。离离心心是是利利用用旋旋转转运运动动的的离离心心力力进进行行分分离离物物料料的的一一种种操操作作，其其中中通通过过过过滤滤介介质质分分离离液液体体和和固固体体者者为为离离心心过过滤滤；利利用用液液体体比比重重的的大大小小分分离离出出不不同同比比重重的的液液体体者者为为离离心心分分离离；利利用用液液固固两两相相比比重重的的差异进行沉降分离者为离心沉降。差异进行沉降分离者为离心沉降。生化物质的分离纯化技术生化物质的分离纯化技术 生化物质分离纯化技术包括：生化物质分离纯化技术包括：生化产品的分离分析和生化产品的制备生化产品的分离分析和生化产品的制备。前者主要对生物体内各组份加以分离前者主要对生物体内各组份加以分离后进行定性、定量鉴定，它不一后进行定性、定量鉴定，它不一定要把某定要把某组分从混合物中分离提取出来；而后者则组分从混合物中分离提取出来；而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分。主要是为了获得生物体内某一单纯组分。为了保护目的物的生理活性及结构上的完整为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物产品的制备中的分离方法多采用温和的性，生物产品的制备中的分离方法多采用温和的“多阶式多阶式”方法进行，即常说的方法进行，即常说的“逐级分离逐级分离”方法。方法。为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，才能达到目的。因此操作的时间长，手续繁琐，给才能达到目的。因此操作的时间长，手续繁琐，给制备工作带来众多影响。制备工作带来众多影响。亲和层析法亲和层析法具有从复杂生物组具有从复杂生物组成中专一的成中专一的“钓出钓出”特异生化成分特异生化成分的特点，目前已在生物大分子，如的特点，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。得到广泛应用。（一）分离纯化原理（一）分离纯化原理 （1 1）根根据据分分子子形形状状和和大大小小不不同同进进行行分分离离。如如差差速速离离心心与与超超离离心心，膜膜分分离离（透透析析、电电渗渗析析）与与超滤法，凝胶过滤法。超滤法，凝胶过滤法。（2 2）根根据据分分子子电电离离性性质质（带带电电性性）的的差差异异进进行行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。（3 3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。（4 4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。择性吸附与吸附层析法。（5 5）根据配体特异性进行分离）根据配体特异性进行分离亲和层析法。亲和层析法。（二）分离纯化的程序和生产设计（二）分离纯化的程序和生产设计（1 1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法；鉴定方法；（2 2）制备物的理化性质稳定性的预备试验；）制备物的理化性质稳定性的预备试验；（3 3）材料处理及抽提方法的选择；）材料处理及抽提方法的选择；（4 4）分离纯化方法的摸索；）分离纯化方法的摸索；（5 5）产物的均一性测定。）产物的均一性测定。1 1分离纯化初期使用方法的选择分离纯化初期使用方法的选择 早早期期分分离离纯纯化化用用萃萃取取，沉沉淀淀，吸吸附附等等一一些些分分辨辨力力低低的的方方法法较较为为有有利利，这这些些方方法法负负荷荷能能力力大大，分分离离量量多多兼兼有有分分离离提提纯纯和和浓浓缩缩作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高分辨能力，而且分辨能力，而且负荷量较大者为合适负荷量较大者为合适，但随着许多，但随着许多新技术的建立，一个特异性方法的分辨力愈高，便新技术的建立，一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高，生化物质的变意味着提纯步骤愈简化，收率愈高，生化物质的变性危险愈少，因此亲和层析法，纤维素离子交换层性危险愈少，因此亲和层析法，纤维素离子交换层析法、连续流动电泳、连续流动等电聚焦等在一定析法、连续流动电泳、连续流动等电聚焦等在一定条件下，也用于从粗提取液中分离制备小量目的物。条件下，也用于从粗提取液中分离制备小量目的物。2 2各种分离纯化方法的使用程序各种分离纯化方法的使用程序 生生化化物物质质的的分分离离都都是是在在液液相相中中进进行行，故故分分离离方方法法主主要要根根据据物物质质的的分分配配系系数数，分分子子量量大大小小，离离子子电电荷荷性性质质及及数数量量和和外外加加环环境境条条件件的的差差别别等等因因素素为基础。为基础。例例如如纯纯化化其其一一两两性性物物质质时时，前前一一步步已已利利用用该该物物质质的的阴阴离离子子性性质质，使使用用了了阴阴离离子子交交换换层层析析法法，下下一一步步提提纯纯时时再再应应用用其其阳阳离离子子性性质质作作层层析析或或电电泳泳分离便会取得较好分离效果。分离便会取得较好分离效果。如有些杂质在各种条件下带电荷性质可能与如有些杂质在各种条件下带电荷性质可能与目的物相似，其分子形状与大小与目的物相差较目的物相似，其分子形状与大小与目的物相差较大，而另一些杂质的分子形状与大小可能与目的大，而另一些杂质的分子形状与大小可能与目的物相似，但在某条件下与目的物的电荷性质不同，物相似，但在某条件下与目的物的电荷性质不同，在这种情况下，先用分子筛，用离心或膜过滤法在这种情况下，先用分子筛，用离心或膜过滤法除去分子量相差较大的杂质，然后在一定除去分子量相差较大的杂质，然后在一定pHpH值和值和离子强度范围下，使目的物变成有利的离子状态，离子强度范围下，使目的物变成有利的离子状态，便能有效地进行层析分离。便能有效地进行层析分离。在在安安排排纯纯化化方方法法顺顺序序时时，还还要要考考虑虑到到有有利利于于减减少少工工序序，提提高高效效率率，如如在在盐盐析析后后采采取取吸吸附附法法，必必然然会会因因离离子子过过多多而而影影响响吸吸附附效效果果，如如增增加加透透析析除除盐盐，则则使使操操作作大大大大复复杂杂化化。如如倒倒过过来来进进行行，先先吸吸附，后盐析就比较合理。附，后盐析就比较合理。3 3分离后期的保护性措施分离后期的保护性措施 在在分分离离操操作作的的后后期期必必须须注注意意避避免免产产品品的的损损失失，主主要要损损失失途途径径是是器器皿皿的的吸吸附附，操操作作过过程程样样品品液液体体的的残残留留，空空气气的的氧氧化化和和某某些些事事先先无无法法了了解解的的因因素素。为为了了取取得得足足够够量量的的样样品品，常常常常需需要要加加大大原原材材料料的的用用量量，并并在在后后期期纯纯化化工工序序中中注注意意保保持持样样品品溶溶液液有有较较高高的的浓浓度度，以以防防制制备备物物在在稀稀溶溶液液中中的的变变性性，有有时时常常加加入入一一些些电电解解质质以以保保护护生生化化物物质质的的活活性性，减减少少样样品品溶溶液液在在器皿中的残留量。器皿中的残留量。（三）分离纯化方法的评估（三）分离纯化方法的评估 每每一一个个分分离离纯纯化化步步骤骤的的好好坏坏，除除了了从从分分辨辨能能力力和和重重现现性性两两方方面面考考虑虑外外，还还要要注注意意方方法法本本身身的的回回收收率率，特特别别是是制制备备某某些些含含量量很很少少的的物物质质时时，回回收收率率的的高高低低十十分分重重要要。一一般般经经过过5 56 6步步提提纯纯后后，活活力力回回收收在在2525以以上上。但但不不同同物物质质的的稳稳定定性性不不同同、分离难易不同，回收率也不同。分离难易不同，回收率也不同。对每一步骤方法的优劣的记录，体现在所得对每一步骤方法的优劣的记录，体现在所得产品产品重量及活性重量及活性平衡关系上。这一关系，可通过平衡关系上。这一关系，可通过每一步骤的分析鉴定求出。例如酶的分离纯化，每一步骤的分析鉴定求出。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。其他活性物质活力及溶液中蛋白质浓度的比例。其他活性物质也可通过测定总活性的变化与样品重量或体积与也可通过测定总活性的变化与样品重量或体积与测出的活力列表进行对比分析，算出每步的提纯测出的活力列表进行对比分析，算出每步的提纯倍数及回收率。倍数及回收率。（四）生化产品纯度的鉴定（四）生化产品纯度的鉴定 一个制备物是否纯，常以一个制备物是否纯，常以“均一性均一性”表示。表示。均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分，均一性的评价常须经过数种方法的验证的成分，均一性的评价常须经过数种方法的验证才能肯定才能肯定。有时某一种测定方法认为该物质是均。有时某一种测定方法认为该物质是均一的，但另一种测定方法却可把它分成两个甚至一的，但另一种测定方法却可把它分成两个甚至更多的组分，这就说明前一种鉴定方法所得的结更多的组分，这就说明前一种鉴定方法所得的结果是片面的。果是片面的。如如果果某某物物质质所所具具有有的的物物理理、化化学学等等方方面面性性质质经经过过几几种种高高灵灵敏敏度度方方法法的的鉴鉴定定都都是是均均一一的的，那那么么大大致致可可以以认认为为它它是是均均一一的的。当当然然，随随着着更更好好的的鉴鉴定定方方法法的的出出现现。还还可可能能发发现现它它不不是是均均一一的的。绝绝对对的的标标准准只只有有把把制制备备物物的的全全部部结结构构搞搞清清楚楚，并并经经过过人人工工合合成成证证明明具具有有相相同同生生理理活活性性时时，才才能能肯肯定定制制备物是绝对纯净的。备物是绝对纯净的。生生物物分分子子纯纯度度的的鉴鉴定定方方法法很很多多，常常用用的的有有溶溶解解度度法法，化化学学组组成成分分析析法法，电电泳泳法法，免免疫疫学学方方法法，离离心心沉沉降降分分析析法法，各各种种色色谱谱法法，生生物物功功能能测测定定法法，以以及及质质谱法谱法等。等。第二部分第二部分实验内容简介实验内容简介猪血清猪血清-球蛋白分离球蛋白分离纯化及鉴定纯化及鉴定实验一、实验一、蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学及其蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学及其生物功能的重要手段。不同的蛋白质的分子量、生物功能的重要手段。不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。种蛋白质。1.1 内容提要内容提要 免疫球蛋白免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig(immunoglobulin,Ig）是人体接受）是人体接受抗原刺激后，由浆细胞所产生的一类具有免疫功能抗原刺激后，由浆细胞所产生的一类具有免疫功能的球状蛋白质，是直接参与免疫反应的抗体蛋白的的球状蛋白质，是直接参与免疫反应的抗体蛋白的总称。各种免疫球蛋白能特异地与相应的抗原结合总称。各种免疫球蛋白能特异地与相应的抗原结合形成抗原形成抗原-抗体复合物（免疫复合物），从而阻断抗抗体复合物（免疫复合物），从而阻断抗原对人体的有害作用，对细菌等抗原的杀伤最后由原对人体的有害作用，对细菌等抗原的杀伤最后由补体去完成。补体去完成。l-球蛋白也称为丙种球蛋白，相对分子量为球蛋白也称为丙种球蛋白，相对分子量为15-15-1616万，沉降系数为万，沉降系数为7S7S；是一组在结构与功能上有；是一组在结构与功能上有密切关系蛋白质。杨据密切关系蛋白质。杨据IgIg的免疫化学特性，可分的免疫化学特性，可分为五大类：为五大类：IgGIgG、IgA IgA、IgM IgM、IgD IgD、IgE IgE，其分，其分子不论哪一类，都由四链组成，即由两条相同的子不论哪一类，都由四链组成，即由两条相同的长多肽链称长多肽链称H H链（又称重链）及两条相同的短肽链链（又称重链）及两条相同的短肽链称称L L链（又称轻链）组成。链（又称轻链）组成。l机体大部分免疫功能力都依赖于机体大部分免疫功能力都依赖于IgGIgG类免疫球蛋白，类免疫球蛋白，它约占免疫球蛋白总量的它约占免疫球蛋白总量的70-90%70-90%。lIgGIgG是人和动物血浆蛋白的重要组分之一，是人和动物血浆蛋白的重要组分之一，制备制备-球蛋白的原料通常用动物血液，球蛋白的原料通常用动物血液，其次还有动物胎盘和初乳乳清。制备方其次还有动物胎盘和初乳乳清。制备方法有低温乙醇法、利凡诺法、盐析法、法有低温乙醇法、利凡诺法、盐析法、离子交换法等。离子交换法等。1.2 1.2 实验目标实验目标掌握免疫球蛋白（掌握免疫球蛋白（IgGIgG ）的原理和方法）的原理和方法 掌握利用紫外法、单向免疫扩散法等测掌握利用紫外法、单向免疫扩散法等测定定IgGIgG含量的方法含量的方法 掌握掌握SDS-PAGE