植物细胞转基因技术.ppt

植物细胞转化的方法种类及特点植物细胞转化的方法种类及特点植物转基因技术植物转基因技术的一般操作过程的一般操作过程 间接转化法：间接转化法：农杆菌介导法农杆菌介导法 病毒介导法病毒介导法植物基因转化技术植物基因转化技术方法方法 DNA直接直接转化转化法法：基因枪法基因枪法 电击法电击法 花粉管通道法花粉管通道法 化学物质诱导法化学物质诱导法 显微注射法显微注射法 脂质体法脂质体法 间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法方法,有农杆菌介导法和病毒介导法有农杆菌介导法和病毒介导法。间接转化法间接转化法 农杆菌介导法是以农杆菌介导法是以农杆菌农杆菌为媒介对植物进行遗为媒介对植物进行遗传转化的方法。传转化的方法。1.农杆菌介导法农杆菌介导法 它是通过根癌农杆菌的它是通过根癌农杆菌的TiTi质粒质粒(T Tumer umer i inducing plasmid)nducing plasmid)和发根农杆菌的和发根农杆菌的RiRi质粒质粒(R Root oot i inducing plasmid)nducing plasmid)上的一段上的一段T-DNAT-DNA区区在农杆菌侵染在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中植物形成肿瘤的过程中,T-DNA,T-DNA可以被转移到植物细可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。胞并插入到染色体基因中。T-DNA T-DNA能够进行能够进行高频率高频率的转移的转移,而且而且TiTi质粒和质粒和RiRi质粒上可以插入到质粒上可以插入到50kb50kb的外源基因的外源基因,因此因此TiTi质粒和质粒和RiRi质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。T-DNAT-DNA可以将其携带的外源基因可以将其携带的外源基因整合整合到植物基到植物基因组中因组中，T-DNA T-DNA 上较重要的是上较重要的是 T T 区两端区两端左右边左右边界界各为各为 25 25bp bp 的重复序列。其中的重复序列。其中1414bp bp 是中心是中心,分分1010bp bp 和和4 4bp bp 两组两组,是完全保守的。这两个边界是是完全保守的。这两个边界是T-DNA T-DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重转移所必需的。其中尤以右边界最为重要。要。T-DNAvir基因基因 Ti 质粒的质粒的 vir 区大小为区大小为30kb,分分 VirA、B、C、D、E、G、H 等等7 个操纵子个操纵子,一共有一共有24 个个基因共同控制着基因共同控制着 T-DNA 的的加工和转移加工和转移,它们总它们总称调控子。称调控子。叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡筛选培养基筛选培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗优点优点：技术较技术较成熟成熟,转化转化效率高效率高操作简单操作简单，不需要特殊仪器不需要特殊仪器，培养培养周期短周期短外源基因多以外源基因多以单拷贝单拷贝或低拷贝插入受体细胞或低拷贝插入受体细胞,稳稳 定性好定性好，减少了共抑制等基因沉默现象减少了共抑制等基因沉默现象。可将较可将较大片段大片段DNA完整地转移到植物基因组中完整地转移到植物基因组中 等等。缺点：缺点：主要转化主要转化双子叶双子叶植物。植物。T-DNA可以在植物染色体的任何区域内插入可以在植物染色体的任何区域内插入,有可有可能导致有益基因的插入能导致有益基因的插入失活失活。迄今所获得的近迄今所获得的近 200种转基因植物中种转基因植物中80%以上是以上是通过根癌农杆菌系统转化获得的。通过根癌农杆菌系统转化获得的。病毒介导法是以病毒介导法是以病毒病毒为媒介对植物进行遗传转化为媒介对植物进行遗传转化 的载体系统的载体系统。具体来说就是将外源基因插入到病具体来说就是将外源基因插入到病 毒基因组中毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源通过病毒对植物细胞的感染而将外源 基因导入植物细胞的一种植物转基因方法基因导入植物细胞的一种植物转基因方法。2.病毒介导法病毒介导法利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效 率比较高率比较高,但它的但它的安全性安全性受到质疑受到质疑,主要用于动物主要用于动物 的基因转移的基因转移。直接转化法直接转化法(又称又称DNA直接导入法直接导入法),它指不依它指不依赖于生物体将赖于生物体将裸露的裸露的DNA直接转移到植物细胞和原直接转移到植物细胞和原生质体中生质体中,导致细胞转化的技术导致细胞转化的技术,与间接转化法相比与间接转化法相比,直接转化法直接转化法不需构建载体不需构建载体,因此又叫无载体介导转化因此又叫无载体介导转化法法。它。它适用于对农杆菌侵染不敏感的植物适用于对农杆菌侵染不敏感的植物,使用此法使用此法的前提是需要建立良好的细胞或原生质体培养及再的前提是需要建立良好的细胞或原生质体培养及再生系统生系统。DNA直接转移法直接转移法 DNA直接导入法最大的优点是直接导入法最大的优点是无需选择宿主无需选择宿主,可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染色体的色体的频率低频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、该方法可以分为化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、电穿孔法、脂质体法、显显微注射法、基因枪法、微注射法、基因枪法、离离子子束介导法和花粉管通道法束介导法和花粉管通道法。基因枪法基因枪法电击法电击法花粉管通道法花粉管通道法化学物质诱导法化学物质诱导法显微注射法显微注射法脂质体法脂质体法 基因枪法最早是由美国康基因枪法最早是由美国康奈尔大学的奈尔大学的Sanford最先提出最先提出的。它通过高速飞行的的。它通过高速飞行的金属颗金属颗粒将包被粒将包被其外的目的基因其外的目的基因直接直接导入到受体细胞内，导入到受体细胞内，最后整合最后整合到植物基因组并得以表达到植物基因组并得以表达从而从而实现基因转化的方法。实现基因转化的方法。1992年，年，世界首例转基因小鼠就是世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。通过该法获得的。1.基因枪法基因枪法DNA1.2 m钨弹钨弹头头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入优点：优点：克服了受体材料的限制，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体不必制备原生质体。实验操作简单易行实验操作简单易行，适合于适合于大多数细胞或组织大多数细胞或组织，具有相当具有相当广泛的应用广泛的应用范围，已经成为植物细胞范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。转化最有效方法之一。缺点：缺点：进去的进去的DNADNA片段片段整合效率极低整合效率极低，遗传稳定性差，遗传稳定性差，拷贝数多，拷贝数多，不易获得再生植株不易获得再生植株。至今为止至今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法该法已成为除了农杆菌介导转化法以外应用最广泛的基因转移技术。此法已在葡萄、以外应用最广泛的基因转移技术。此法已在葡萄、水稻等植物转基因中水稻等植物转基因中应用应用,并获得转基因植株。基因并获得转基因植株。基因枪法也可以有效地用于叶绿体的转化枪法也可以有效地用于叶绿体的转化，还可以转移还可以转移RNA、DNA克隆等。克隆等。是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体原生质体的的质膜上形成质膜上形成瞬时可逆瞬时可逆性开放小孔性开放小孔,为外源为外源DNA提供通提供通道道,借此导入借此导入DNA等遗传物质等遗传物质,达到转化的达到转化的目的。目的。由由于质膜具有可修复性于质膜具有可修复性,外加电压造成的膜穿孔可在一外加电压造成的膜穿孔可在一定的时间内定的时间内自动修复自动修复,从而使细胞恢复到正常的生理从而使细胞恢复到正常的生理状况状况。2.电击法电击法植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入电击混合入电击缓冲液缓冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化优点优点：操作简便，操作简便，可以一次转化可以一次转化许多许多原生质体原生质体，转化效，转化效 率较高，特别适于瞬间表达。率较高，特别适于瞬间表达。缺点缺点：有有原生质体培养原生质体培养的麻烦的麻烦,电穿孔易造成原生质体损电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低伤使再生率降低。该法已在甘蔗、大麦小孢子、剪股颖等植物的基该法已在甘蔗、大麦小孢子、剪股颖等植物的基因转化当中因转化当中。花粉管通道法是利用花粉管通道法是利用植物授粉后植物授粉后,所形成的所形成的天然花粉管通道天然花粉管通道,经珠经珠心通道心通道,将外源将外源DNADNA携携带入胚囊带入胚囊,从而达到转从而达到转化目的的一种植物转化目的的一种植物转基因方法基因方法。3.花粉管通道法花粉管通道法优点优点：适用范围广适用范围广，不依赖组织培养不依赖组织培养人工再生人工再生植植株；株；可直接获得可直接获得转基因种子转基因种子，育种时间短育种时间短，在鉴定在鉴定 时可直接针对目的性状的表现型来进行时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快简单快 捷；捷；转化速度较快转化速度较快，变异性状稳定较快；变异性状稳定较快；方法简单方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备不需要复杂昂贵的仪器设备。缺点缺点：转化受体受植物转化受体受植物花期的限制花期的限制，同时必须充分了解同时必须充分了解 每一种植物的开花受精的时间过程。每一种植物的开花受精的时间过程。在自然田间进行操作，受在自然田间进行操作，受环境环境条件的影响很大。条件的影响很大。操作的经验性很强操作的经验性很强,需要一定的需要一定的技巧技巧。利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的转基因植株。转基因植株。化学物质诱导法是以化学物质诱导法是以原生质体原生质体为受体为受体,借助于特借助于特定的定的化学物质化学物质诱导诱导DNA直接导入植物细胞的直接导入植物细胞的方方法法。常用的转化细胞的化学物质有常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇聚乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸多聚鸟氨酸)、PVA(聚乙烯醇聚乙烯醇)等等,其中其中PEG法应用较多法应用较多,效果较好效果较好。PEG法是一种通过化学物质法是一种通过化学物质PEG处理去壁的原处理去壁的原生质体作为转化受体生质体作为转化受体,改变细胞膜的通透性改变细胞膜的通透性使原使原生质体获得转化的方法生质体获得转化的方法。4.化学物质诱导法化学物质诱导法优点：优点：PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性 好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很 少产生。少产生。缺点缺点：原生质体培养再生难度较大；原生质体培养再生难度较大；原生质体再生培养的转化植株变异率高原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白易产生白 化苗化苗，且，且由于由于 PEG法对原生质体活力有害，法对原生质体活力有害，转化转化 率低率低。应用应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡椒等植物的转基因植株。椒等植物的转基因植株。显显微注射法是使用毛细微管微注射法是使用毛细微管(一般针尖的直径为一般针尖的直径为 0.5nm),在显微镜下将外源在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞注射入植物细胞 或原生质体中的一种直接而完善的方法或原生质体中的一种直接而完善的方法。5.显微注射显微注射DNA该方法是该方法是Pena等等1987年首创的年首创的,在用此方法进行在用此方法进行 基因导入时基因导入时,通常需要把原生质体或培养的细胞固通常需要把原生质体或培养的细胞固 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处理或用聚赖氨酸处理 使原生质体附着在玻璃平板上使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固着也可以通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口的毛细管将原生质体吸着在管口,再进行操作再进行操作。优点：优点：转化率高，特别是在没有合适的转化率高，特别是在没有合适的DNA载体系统时载体系统时 更有价值更有价值对转移物质没有限制对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接可选择受体细胞的核的接 受位点受位点受体不用特殊的选择系统受体不用特殊的选择系统可以控制转移的量和转移物的浓度可以控制转移的量和转移物的浓度 缺点：缺点：设备和技术的要求较高设备和技术的要求较高要想获得转化的植株要想获得转化的植株,需要注射大量的细胞或原生需要注射大量的细胞或原生 质体，费时费工质体，费时费工对细胞有损伤对细胞有损伤，一次处理细胞数量不能太多一次处理细胞数量不能太多，比，比 较适合大细胞操作，主要用于动物的基因转化中较适合大细胞操作，主要用于动物的基因转化中脂质体是根据生物膜的结构和功能特性脂质体是根据生物膜的结构和功能特性，人工用人工用 脂类化合物合成的双层膜囊脂类化合物合成的双层膜囊。脂质体法脂质体法是是Dellaporta等在等在1981年创造的年创造的,就是将就是将 包含外源基因的脂质体与植物原生质体融合包含外源基因的脂质体与植物原生质体融合,从而从而 达到转基因目的一种转化方法达到转基因目的一种转化方法。6.脂质体法脂质体法优点：优点：可避免可避免DNA在导入受体细胞之前被核酸酶降解在导入受体细胞之前被核酸酶降解；适用的植物种类广泛重复性高适用的植物种类广泛重复性高,包装在脂质体内的包装在脂质体内的 DNA或或RNA可稳定地贮藏可稳定地贮藏。缺点：缺点：在包装在包装DNA时必须有短时间的超声处理时必须有短时间的超声处理,会使相当会使相当 多的多的DNA断裂；断裂；所用材料必使用具有全能性的原生质体作为受体所用材料必使用具有全能性的原生质体作为受体 细胞；细胞；转化效率较低转化效率较低。主要用于动物的基因转化主要用于动物的基因转化,在植物上此方法介导的在植物上此方法介导的基因转移在烟草、青菜等植物上有报道。基因转移在烟草、青菜等植物上有报道。几种植物转基因方法比较几种植物转基因方法比较谢谢谢谢！