细菌转化实验.ppt
实验一实验一 细菌质粒细菌质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化菌体菌体pcr跟普通跟普通PCR原理是一样的，因为原理是一样的，因为94度变形可以裂解细菌，释放出度变形可以裂解细菌，释放出DNA，所以不用提质粒也可以，所以不用提质粒也可以PCR出来条带出来条带 因为培养基含有水分，恒温培养时因为培养基含有水分，恒温培养时水分蒸发出来在培养皿盖上凝结，水分蒸发出来在培养皿盖上凝结，水滴落下来会冲坏菌落水滴落下来会冲坏菌落，不利于培，不利于培养观察，所以需要倒置培养养观察，所以需要倒置培养 一、实验目的一、实验目的 通过细菌质粒通过细菌质粒DNADNA的提取，掌握共价闭合环状的提取，掌握共价闭合环状DNADNA的提取方法。的提取方法。二、实验原理二、实验原理1.细菌中有两种细菌中有两种DNA，即染色体即染色体DNA和质粒和质粒DNA。2.质粒质粒DNA的提取方法有三种：的提取方法有三种：碱裂解法碱裂解法、煮沸法和去污、煮沸法和去污剂（如剂（如Triton和和SDS）裂解法。裂解法。3.碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。难以复性。三、实验菌株三、实验菌株含质粒载体含质粒载体pGEM-TpGEM-T的大肠杆菌（的大肠杆菌（E.coli.E.coli.）四、实验用具和药品四、实验用具和药品实验用具实验用具摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL15mL）及）及塞子、离心管（塞子、离心管（1.5mL1.5mL）。LB培养基配方：培养基配方：ddH2O950mL细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract）5gNaCl 10g琼脂粉（配制固体培养基时需加入）15gNaOH调节pH至7.0（5mol/L 约0.2mL），高压灭菌固体平板上添加氨苄青霉素实验药品实验药品溶液溶液（高压灭菌）：（高压灭菌）：50 mmol/L 50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl 25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0pH8.0）10 mmol/L EDTA 10 mmol/L EDTA（pH8.0pH8.0）溶液溶液（现用现配）：（现用现配）：0.2 mol/L NaOH(0.2 mol/L NaOH(临用前用临用前用10mol/L10mol/L的溶液稀释）的溶液稀释）1%SDS 1%SDS溶液溶液：5 mol/L 5 mol/L乙酸钾乙酸钾 60mL 60mL 冰乙酸冰乙酸 11.5mL 11.5mL 水水 28.5mL 28.5mL五、实验步骤五、实验步骤方法：活化方法：活化-扩增扩增-离心离心-裂解裂解-离心离心-抽提抽提-沉淀沉淀-洗涤洗涤-溶解溶解（一）细菌繁殖（一）细菌繁殖实验前实验前2 2天晚上天晚上：将冻存的菌株取出，划线接种于将冻存的菌株取出，划线接种于LBLB（ampamp）平板上，）平板上，置于置于3737培养箱中，培养箱中，倒置培养倒置培养至菌落长成。至菌落长成。实验前实验前1 1天晚上：天晚上：从从LBLB平板上挑取单个菌落，接种于平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB6mlLB液体培养基（加入氨液体培养基（加入氨苄青霉素）中，苄青霉素）中，3737，过夜振荡（，过夜振荡（200r/min200r/min）培养。）培养。（二）菌体收集（二）菌体收集实验当天实验当天 ：1.1.将过夜培养的菌体转入将过夜培养的菌体转入1.5mL1.5mL离心管，离心管，5000r/min5000r/min离心离心2min2min；2.2.弃上清弃上清（三）碱裂解法提取质粒（三）碱裂解法提取质粒DNADNA 全套操作约需全套操作约需1 1小时，详细说明如下。小时，详细说明如下。3.3.加入加入250 l250 l的的Solution Solution（含（含RNase A1RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。）充分悬浮细菌沉淀。注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（VortexVortex）等剧烈振荡使）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。菌体充分悬浮。4.4.加入加入250 l250 l的的Solution Solution 轻轻地上下翻转混合轻轻地上下翻转混合5 56 6次，使菌体充分裂次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。解，形成透明溶液。注）此步骤不宜超过注）此步骤不宜超过5 5分钟。分钟。5.5.加入加入400 l400 l的的44预冷的预冷的Solution Solution，轻轻上下翻转混合，轻轻上下翻转混合5 56 6次，直至次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置形成紧实凝集块，然后室温静置2 2分钟。分钟。6.6.室温室温12,000 rpm12,000 rpm离心离心1010分钟，取上清。分钟，取上清。注）此时注）此时44离心不利于沉淀沉降。离心不利于沉淀沉降。7.7.将试剂盒中的将试剂盒中的Spin ColumnSpin Column（离心柱）安置于（离心柱）安置于Collection Tube Collection Tube（收集管）（收集管）上。上。8.8.将上述操作将上述操作6 6的上清液转移至的上清液转移至Spin ColumnSpin Column中，中，12,000 rpm12,000 rpm离心离心1 1分钟，弃分钟，弃滤液。滤液。9.9.将将500 l的的Rinse A加入加入Spin Column中，中，12,000 rpm离心离心30秒钟，秒钟，弃滤液。弃滤液。10.10.将将700 l的的Rinse（冲洗）（冲洗）B加加入入Spin Column中，中，12,000 rpm离离心心30秒钟，弃滤液。秒钟，弃滤液。11.11.重复操作步骤重复操作步骤10。12.12.将将Spin Column安置于安置于Collection Tube上，上，12,000 rpm离心离心1分钟。分钟。13.13.将将Spin Column安置于新的安置于新的1.5 ml的离心管上，在的离心管上，在Spin Column膜的中央膜的中央处加入处加入60 l的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或Elution Buffer（洗脱缓冲液），室温静置（洗脱缓冲液），室温静置1分钟。分钟。注）把灭菌蒸馏水或注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热加热至至60使用时有利于提高洗脱效率使用时有利于提高洗脱效率14.14.12,000 rpm离心离心1分钟洗脱分钟洗脱DNA。六、实验作业六、实验作业1.1.按上述实验步骤提取质粒按上述实验步骤提取质粒DNADNA。1.1.思考本实验的关键步骤是什么？思考本实验的关键步骤是什么？2.2.答：本实验的关键是溶液答：本实验的关键是溶液重悬须充分，溶液重悬须充分，溶液混合混合须温和。须温和。用用binding buffer是为了增加洗脱柱对核酸的是为了增加洗脱柱对核酸的结合活性；结合活性；wash solution是洗掉柱子里除核酸物质以是洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质；而外的杂质；而elution buffer就是最后把就是最后把DNA从柱子上从柱子上洗脱下来使用的溶液，一般是洗脱下来使用的溶液，一般是pH=8.0的的TE，dd水也可水也可以。以。实验二实验二 大肠杆菌的遗传转化大肠杆菌的遗传转化一、实验目的一、实验目的通过实验了解原核生物实现基因转移的途径，掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。二、实验原理二、实验原理1.1.转化（转化（transformationtransformation）是指一种生物由于接受了另一是指一种生物由于接受了另一种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。2.2.细菌处于容易吸收外源细菌处于容易吸收外源DNADNA的状态叫的状态叫感受态感受态。3.3.用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。4.4.目前应用较广的目前应用较广的转化转化方法有两种：方法有两种：CaClCaCl2 2转化法（化学转转化法（化学转化法）和电转化法。化法）和电转化法。5.5.CaClCaCl2 2转化法的原理是在低温（转化法的原理是在低温（00）和低渗的）和低渗的CaClCaCl2 2溶液溶液中，菌体膨胀，转化混合物中的中，菌体膨胀，转化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的羟基酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经4242短时间热击，短时间热击，促进细胞吸收促进细胞吸收DNADNA复合物。复合物。三、实验材料三、实验材料1.质粒pGEM-T easy：编码氨苄青霉素（Ampr）的抗性基因2.大肠杆菌（E.coli）DH5菌株：氨苄青霉素敏感型（Amp-）四、实验用品四、实验用品1.超净工作台、摇床2.水浴锅、离心机3.分光光度计、移液器及枪头4.三角瓶（500mL、200mL）5.离心管（50mL、1.5mL）6.平板（Ampr、Amp-）、LB培养基7.冰冷的CaCl2溶液、质粒DNAu 0.1M CaCl2溶液配制：称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。u质粒的提取：利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。五、实验步骤五、实验步骤（一）感受态的制备（一）感受态的制备(此步骤已完成）此步骤已完成）1、E.Coli涂布于平板（Amp-），37，培养12h；2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养12h；3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mL LB的200mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养23h，每隔0.5h测OD600值；4、当OD600=0.30.4（对数生长期的OD600=0.6）取出；冰上放置1060min；5、4，5000rpm，离心10min，弃上清；6、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞；7、冰上放置15min；8、4，5000rpm，离心10min，弃上清；9、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞；10、用于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油，-70保存。（二）转化（冰上操作）（二）转化（冰上操作）1、1.5mL管中加入感受态细胞50L和待转化的质粒2L，冰浴30min30min；2、42热击90sec90sec（勿晃动管子）；3、冰浴2min2min；4、加入37预热的LB至1mL；5、37，振荡（50r/min）培养2h2h；6、取200L涂板（Ampr），37培养12-16h12-16h；7、对生长出的白色菌落计数，计算出每微升质粒的转化率。六、实验作业六、实验作业1.计算出大肠杆菌的转化率，转化率=平板上的白色菌落数2L。2.转化过程中，会不会出现假阳性的结果，为什么？如何排除？3.答：转化过程中，经常出现假阳性。原因很多，如质粒、菌株不纯，载体自连等。详细的解释见分子遗传学。
