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第八章第八章 微生物遗传变异与菌种保藏微生物遗传变异与菌种保藏本章内容本章内容第一节第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础第二节第二节 基因突变及修复基因突变及修复第三节第三节 基因重组基因重组第四节第四节 微生物育种微生物育种第五节第五节 菌种的衰退、复壮及保藏菌种的衰退、复壮及保藏 第一节第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础三个经典实验三个经典实验：转化实验转化实验 噬菌体的感染实验噬菌体的感染实验 植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验实验材料实验材料：实验方法实验方法：动物实验动物实验细菌培养实验细菌培养实验S S型菌无细胞抽提液试验型菌无细胞抽提液试验（一）转化实验（一）转化实验Griffith（1928）Avery（1944）实验材料：实验材料：肺炎双球菌肺炎双球菌光滑型（光滑型（S）粗糙型（粗糙型（R）有有 荚荚 膜膜菌落光滑菌落光滑分泌毒素分泌毒素致致 病病无无 荚荚 膜膜菌落粗糙菌落粗糙无无 毒毒不不 致致 病病SSS三个血清型三个血清型RRR三个血清型三个血清型活活死死死死加活加活R菌或死菌或死S菌菌加活加活S菌菌加加活活R菌和热死菌和热死S菌菌抽血分离抽血分离活的活的S菌菌转化实验（转化实验（1）动物实验）动物实验?热死热死 无菌落生长无菌落生长 体外培养体外培养 活菌活菌 体外培养体外培养 菌落菌落 菌落多菌落多菌落少菌落少 体外混合培养体外混合培养热死热死 活菌活菌 说明：加热杀死的说明：加热杀死的S型细菌中可能存在某种物质，型细菌中可能存在某种物质，能通过某种方式进入能通过某种方式进入R型细菌。型细菌。转化实验转化实验（2 2）细菌培养实验细菌培养实验大量大量R R菌落菌落活活R R菌菌S S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液+活活R R菌菌+S S菌菌DNADNAS S菌落菌落S S菌菌PrPrS S菌多糖菌多糖R R菌落菌落活活R R菌菌+说明：遗传因子是以说明：遗传因子是以DNA为物质基础。为物质基础。转化实验转化实验（3 3）S S型菌无细胞抽提液试验型菌无细胞抽提液试验（二）（二）噬菌体的感染实验噬菌体的感染实验吸附吸附10分钟后分钟后搅动搅动离心离心上清液上清液沉沉 淀淀离心离心,分出上清液和沉淀分出上清液和沉淀.沉淀细胞进一步培养，产生大量的子代噬菌体沉淀细胞进一步培养，产生大量的子代噬菌体(30%P32、1%35）。证明：在其证明：在其DNA中，含有包括中，含有包括Pro外壳在内的整套遗传物质。外壳在内的整套遗传物质。植物病毒植物病毒蛋白质蛋白质和和RNARNA可以人为地分开可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.甲乙甲乙r r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒 乙甲乙甲r r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒 （三）（三）植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 TMV:烟草花叶病毒烟草花叶病毒 HRV:霍氏车前花叶病毒（霍氏车前花叶病毒（RNA)证明遗传物质是证明遗传物质是RNATMVHRVHRVTMV原始株原始株 拆开拆开 重建重建 感染感染 分离纯化分离纯化 植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 第二节第二节 基因突变及修复基因突变及修复一一 基因突变基因突变二二 DNA损伤的修复损伤的修复一一 基因突变基因突变（一）突变类型（一）突变类型（二）突变的特点（二）突变的特点（一）（一）突变类型突变类型1 碱基变化与遗传信息的改变碱基变化与遗传信息的改变2 表型变化表型变化1 碱基变化与遗传信息的改变碱基变化与遗传信息的改变（1）错义突变（错义突变（missensemutation）：）：某个密码的第一个某个密码的第一个碱基或第二个碱基发生转换或颠换，使编码某一氨基酸的密码变为碱基或第二个碱基发生转换或颠换，使编码某一氨基酸的密码变为编码另一个氨基酸的密码。氨基酸置换编码另一个氨基酸的密码。氨基酸置换（2）无义突变（无义突变（nonsense mutation）：）：某个密码的第一个某个密码的第一个碱基或第二、第三个碱基发生转换或颠换，变为不编码任何氨基酸碱基或第二、第三个碱基发生转换或颠换，变为不编码任何氨基酸的密码。终止密码子（的密码。终止密码子（UAA,UAG,UGA)。（3）同义突变（同义突变（samesense mutation）：发生改变的碱基发生改变的碱基位于密码的第位于密码的第3位，一般编码同一个氨基酸。比如简并密码。编码位，一般编码同一个氨基酸。比如简并密码。编码的氨基酸与野生型氨基酸相同。的氨基酸与野生型氨基酸相同。（4）移码突变（移码突变（frameshift mutation）：DNA序列中序列中1-2个个核苷酸缺失或插入，翻译的阅读框改变，导致氨基酸序列改变。核苷酸缺失或插入，翻译的阅读框改变，导致氨基酸序列改变。2 表型变化表型变化（1）营养缺陷型）营养缺陷型（2）抗药性突变型）抗药性突变型（3）条件致死突变型）条件致死突变型（4）形态突变型）形态突变型（1）营养缺陷型）营养缺陷型(auxotroph)由于代谢障碍成为必须添加某种物质才能生长的突变株。由于代谢障碍成为必须添加某种物质才能生长的突变株。腺嘌呤突变株腺嘌呤突变株Ade-（完全培养基）（完全培养基）腺嘌呤野生型菌株腺嘌呤野生型菌株Ade+（基本培养基和完全培养基）。（基本培养基和完全培养基）。营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育 种的重要手段。种的重要手段。用影印平板进行分离筛选。用影印平板进行分离筛选。完全培养基完全培养基基本培养基基本培养基完全培养基完全培养基（2）抗药性突变型（）抗药性突变型（resistant mutant)由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的一种突变型。是抗生素，产生抗性的一种突变型。在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。长。在某一条件下具有致死效应，在另一条件下没有致死效应。在某一条件下具有致死效应，在另一条件下没有致死效应。合成关键性酶的基因发生了突变。合成关键性酶的基因发生了突变。如如温度敏感突变温度敏感突变t ts s（4242致死，致死，25253030存活）。存活）。用影印平板进行分离筛选。用影印平板进行分离筛选。（3）条件致死突变型）条件致死突变型（conditional lethal mutant）细胞形态突变细胞形态突变 菌落形态突变菌落形态突变颜色突变颜色突变噬菌斑形态突变噬菌斑形态突变（4）形态突变型（形态突变型（morphological mutant）包括包括（二）（二）突变的特点突变的特点1 1 非对应性非对应性：环境与变异无对应性。：环境与变异无对应性。2 2 自发性：自发性：非人为的诱变因素下发生。非人为的诱变因素下发生。3 3 规律性规律性：某一特定性的突变率具规律性。：某一特定性的突变率具规律性。4 4 独立性独立性：一个基因的突变对其它基因突变无影响。：一个基因的突变对其它基因突变无影响。5 5 稀有性稀有性：生物自发突变率为：生物自发突变率为1010-6-61010-12-12。6 6 诱变性诱变性：诱变剂可提高突变率：诱变剂可提高突变率1010 10105 5。7 7 稳定性稳定性：突变性状稳定、可遗传。：突变性状稳定、可遗传。8 8 可逆性可逆性：有回复突变。：有回复突变。二二 DNA损伤及修复（自学）损伤及修复（自学）1 1 光复活作用（光复活作用（PhotoreactivationPhotoreactivation）2 2 切除修复（切除修复（Excision RepairExcision Repair）3 3 重组修复（重组修复（Recombination RepairRecombination Repair）4 4 SOSSOS修复（修复（SOS RepairSOS Repair）光复活作用（光复活作用（PhotoreactivationPhotoreactivation）Thymine DimerPhotoreactivation光解酶光解酶Phr在在黑暗黑暗中专一地识别嘧啶二中专一地识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶聚体，并与之结合，形成酶-DNA复合复合物，当物，当有光有光时，酶利用光能时，酶利用光能将二聚体将二聚体拆开拆开，恢复原状，酶再释放出来。，恢复原状，酶再释放出来。正常可见光下光诱导系统的修复。正常可见光下光诱导系统的修复。photoreactivation enzyme光裂合酶光裂合酶photolyasephotolyase烷基转移酶烷基转移酶AlkyltransferasesAlkyltransferases切割嘧啶二聚体，分开。切割嘧啶二聚体，分开。胸腺嘧啶二聚体光复活酶可见光 光的吸收酶的释放光复活过程光复活过程第三节第三节 基因重组基因重组一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组 二、真核生物的基因重组二、真核生物的基因重组基因重组基因重组 把两个把两个不同性状不同性状个体内的个体内的遗传基因遗传基因转移转移到到一起一起，经遗传，经遗传 物质重新组合后，物质重新组合后，形成新遗传型个体形成新遗传型个体的方式。的方式。基因重组基因重组分子水平的杂交分子水平的杂交 一般杂交一般杂交细胞水平细胞水平如：如：甲甲 乙乙生长快、产量低生长快、产量低 生长慢、产量高生长慢、产量高 基因重组基因重组 生长快、产量高生长快、产量高一一 原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组（一）（一）转化（转化（transformation)transformation)（二）二）转导转导(transduction)transduction)（三）三）接合接合(conjugation)conjugation)（一）转化（一）转化（transformation)transformation)概念概念 受体细胞受体细胞(receptor)receptor)直接直接吸收吸收来自来自供体细胞供体细胞(donor)donor)的的DNADNA片断片断，并把它整合到自己的基因组中，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。1.1.感受态感受态2.2.感受态因子感受态因子3.3.转化因子转化因子4.4.转化的特点转化的特点 （1 1）感受态）感受态：受体细胞最易接受外源：受体细胞最易接受外源DNADNA片段并实现其转化片段并实现其转化 的一种的一种生理状态生理状态。（2 2）转化的决定因素）转化的决定因素：不同菌株的亲缘关系：不同菌株的亲缘关系;受体细胞是否受体细胞是否 处于感受态；不同菌出现感受态的时处于感受态；不同菌出现感受态的时 间不同。间不同。（3 3）感受态的获得：）感受态的获得：自然获得；用自然获得；用CaCl2处理细胞；电穿孔处理细胞；电穿孔1.1.感受态感受态 细菌自身分泌的一种胞外蛋白质，分子量为细菌自身分泌的一种胞外蛋白质，分子量为5 51010kDkD。其作用为：其作用为：（1 1）催化转化，促进外来）催化转化，促进外来DNADNA片段吸收。片段吸收。（2 2）可降解细胞表面某种成分，使）可降解细胞表面某种成分，使DNADNA受体暴露。受体暴露。不同菌细胞不同菌细胞DNADNA受体位点不同。受体位点不同。有的菌感受态因子只对同种菌起作用。有的菌感受态因子只对同种菌起作用。2.2.感受态因子感受态因子3.3.转化因子转化因子（1 1）转化因子由供体提供。转化因子由供体提供。（2 2）一般为线状或闭合环状；单链或双链；双链一般为线状或闭合环状；单链或双链；双链 有转化能力，单链没有。有转化能力，单链没有。（3 3）自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里 通过提取获得。通过提取获得。（4 4）转化的频率往往很低，一般为转化的频率往往很低，一般为0.10.11%1%。据研究，。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转 化频率最高。化频率最高。游离的片断叫转化因子。游离的片断叫转化因子。4.转化的特点转化的特点不需两个细胞直接接触，供体不需两个细胞直接接触，供体DNADNA提取出来，注入受体即可。提取出来，注入受体即可。在细菌的感受态出在细菌的感受态出现时，具有从周围现时，具有从周围环境吸收环境吸收DNA分子分子而不被而不被DNA酶破坏酶破坏的生理特性。处于的生理特性。处于感受态的细胞，吸感受态的细胞，吸收收DNA的能力有时的能力有时可比一般细胞大可比一般细胞大1000倍。倍。（二）（二）转导转导(transduction)(transduction)以以温和噬菌体温和噬菌体为媒介，把为媒介，把供体细胞供体细胞的的DNADNA或或RNARNA片断转移到片断转移到受体细胞受体细胞中，从而使后者获中，从而使后者获得前者的部分遗传性状。得前者的部分遗传性状。不需要细胞间直接接触。但需要媒介。不需要细胞间直接接触。但需要媒介。普遍转导（普遍转导（Generalized Transduction）噬菌体可以转导供体染色体的任何部分到受体细胞中。噬菌体可以转导供体染色体的任何部分到受体细胞中。局限转导（局限转导（Specialized Transduction）噬菌体总是携带同样的片段到受体细胞中。噬菌体总是携带同样的片段到受体细胞中。结果结果10-5频率出现野生型菌株。（基本培养基）频率出现野生型菌株。（基本培养基）U型管试验：型管试验：也能出现野生型菌株也能出现野生型菌株（基本培养基）（基本培养基）在对鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株在对鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株的研究中发现的研究中发现A+B-A-B+A+B+A+B+供体供体A-B+A+B-多数受体多数受体形成溶源菌形成溶源菌A-B+A+B-少数受体少数受体A+B+经重组形成转导子经重组形成转导子A:组氨酸组氨酸B:色氨酸色氨酸Generalized TransductionSpecialized Transduction 被转导的基因与噬菌体被转导的基因与噬菌体DNA共价连接，与噬菌体共价连接，与噬菌体 DNA一起进行复制包装以及导入受体细胞一起进行复制包装以及导入受体细胞。噬菌体携带特殊的染色体片段将固定的个别基因导噬菌体携带特殊的染色体片段将固定的个别基因导 入受体。入受体。普遍转导和局限转导的不同之处：普遍转导和局限转导的不同之处：Specialized Transduction原噬菌体原噬菌体供体供体DNA 受体受体DNA（三）接合（三）接合(conjugation)(conjugation)概念：概念：供体细胞与受体细胞供体细胞与受体细胞直接接触直接接触，借性菌毛，借性菌毛 传递大段传递大段DNADNA的过程。在受体细胞中发生交的过程。在受体细胞中发生交 换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的 现象，称为接合。现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子接合子。+A+B+C-D-A-B-C+D+接接 合合 及及 其其 发发 现（大肠杆菌）现（大肠杆菌）A+B+C+D+A:生物素生物素B:甲硫氨酸甲硫氨酸C:苏氨酸苏氨酸D:赖氨酸赖氨酸基本基本培养基培养基A+B+C-D-A-B-C+D+Davis（1950）U型管试验型管试验两个菌株不两个菌株不能直接接触，能直接接触，只能是培养只能是培养液和营养物液和营养物质（包括质（包括DNA分子）分子）可以通过。可以通过。完全完全培养基培养基完全完全培养基培养基A+B+C-D-A-B-C+D+基本基本培养基培养基没有菌生长没有菌生长1.F+与与F-杂交杂交F+细菌的表面有称作性菌毛性菌毛（sex pili）的细长菌毛，由此与F细菌接合，一旦接触后，菌毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道-细胞质桥细胞质桥或称结合管结合管（conjugation tube），F+细胞的F因子通过接合管向F细胞转递：使F变成F，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F细胞间的接合。F F+细菌：含有细菌：含有F F因子因子F F-细菌：不含有细菌：不含有F F因子因子F因子就是因子就是F质粒质粒。滚环式复制滚环式复制，式 2.HfrF-杂交杂交HfrHfr菌的形成菌的形成 F F质粒整合到细菌染色体上。质粒整合到细菌染色体上。质粒和染色体共质粒和染色体共有插入序列和转有插入序列和转座因子。这些转座因子。这些转座因子之间的同座因子之间的同源重组导致质粒源重组导致质粒的整合。的整合。HfrF-杂交杂交结果仍是结果仍是Hfr细胞和细胞和F-细胞。细胞。Hfr和和F+的联系和区别的联系和区别 联系联系：（：（1）都是雄性菌，含有）都是雄性菌，含有F质粒。质粒。（2）Hfr F质粒与染色体整合质粒与染色体整合。F+F质粒游离在染色体外。质粒游离在染色体外。区别区别：（1）Hfr 的的F质粒转移频率低，质粒转移频率低，F+的的F质粒转移频率高；质粒转移频率高；（2）Hfr 的的F质粒整合，质粒整合，F+的的F质粒游离。质粒游离。3.F 转导转导F F 因子因子因子因子携带有宿主染色体基因携带有宿主染色体基因的的F F因子。因子。从从HfrHfr菌中染色体上脱菌中染色体上脱离下来的离下来的F F质粒有时会质粒有时会携带相邻的染色体基因携带相邻的染色体基因或或DNADNA片段，称为片段，称为FF质质粒（粒（FF因子），因子），该菌该菌被称为被称为FF菌。菌。F因子因子 给体的部分染色体基因给体的部分染色体基因 随随F一起转入受体细胞。一起转入受体细胞。基因不需整合就可表达。基因不需整合就可表达。利用利用F 因子形成部分二因子形成部分二 倍体叫做性导倍体叫做性导 sexduction。FF-杂交杂交注意区别注意区别F+菌、菌、Hfr 菌、菌、F 菌的不同！菌的不同！转化、转导、接合三者的根本区别转化、转导、接合三者的根本区别在于在于DNADNA转移的方式不同转移的方式不同转化转化：供体供体DNADNA片断片断注入受体细胞，通过注入受体细胞，通过细胞膜细胞膜接合：接合：供体进入受体通过供体进入受体通过性菌毛。性菌毛。转导：转导：供体供体DNADNA片断通过片断通过媒介噬菌体媒介噬菌体携带进入受体。携带进入受体。二二 真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组（一）有性生殖（一）有性生殖（二）（二）准性生殖（准性生殖（parasexual hybridizationparasexual hybridization）（三）酵母菌的接合型遗传（三）酵母菌的接合型遗传（一）（一）有性生殖有性生殖 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种生殖方式。重组，并产生新遗传型后代的一种生殖方式。凡是能产生凡是能产生有性孢子有性孢子的酵母菌或霉菌，原则的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物有性生殖相似的方法上都能采用与高等动、植物有性生殖相似的方法进行有性繁殖。进行有性繁殖。一部分真菌的减数分裂发生在一部分真菌的减数分裂发生在1个闭合的子囊壳个闭合的子囊壳中，具较短的生活周期，中，具较短的生活周期，为遗传重组的研究带来为遗传重组的研究带来极大方便。极大方便。子囊孢子形成过程子囊孢子形成过程粗糙脉胞霉：粗糙脉胞霉：1个子囊内产生的双倍体个子囊内产生的双倍体核直接减数分裂后所产生核直接减数分裂后所产生的的4个孢子直线排列在子个孢子直线排列在子囊内（为顺序排列四分体）囊内（为顺序排列四分体），再进行一次有丝分裂，再进行一次有丝分裂，产生产生8个子囊孢子。个子囊孢子。AAAAaaaa、aaaaAAAA、AAaaAAaaaaAAaaAA、AAaaaaAA、aaAAAAaa8个子囊孢子的排列：个子囊孢子的排列：粗糙脉胞霉（粗糙脉胞霉（面包霉）的生活史面包霉）的生活史分生孢子（分生孢子（n）菌丝菌丝（n）子实体子实体核融合核融合合子核合子核(2n)交配型交配型A交配型交配型B减数分裂减数分裂I减数分裂减数分裂II有丝分裂有丝分裂萌发萌发(n)子囊孢子（子囊孢子（n）粗糙脉胞霉粗糙脉胞霉减数分裂减数分裂（二）准性生殖（二）准性生殖（parasexual reproduction）1.1.准性生殖准性生殖2.2.准性生殖的意义准性生殖的意义3.3.过程过程 1 准性生殖准性生殖同种异株同种异株的两个体细胞融合，不经减数分的两个体细胞融合，不经减数分裂而导致裂而导致低频低频基因重组发生的一种繁殖方式。基因重组发生的一种繁殖方式。（单倍体体细胞重组单倍体体细胞重组）准性生殖与有性生殖的不同：准性生殖与有性生殖的不同：重组体细胞和一般营养体细胞外形没有不同，重组体细胞和一般营养体细胞外形没有不同，不产生在特殊的囊器中。不产生在特殊的囊器中。染色体的交换及单倍体化过程没有规律性。染色体的交换及单倍体化过程没有规律性。2 准性生殖的意义准性生殖的意义 对一些对一些没有有性过程没有有性过程但有重要生产价但有重要生产价 值的值的半知菌半知菌来说，进行基因在染色体来说，进行基因在染色体 上上定性研究定性研究、杂交育种杂交育种，准性生殖提，准性生殖提 供了一个重要的手段。供了一个重要的手段。发现存在于发现存在于构巢曲菌构巢曲菌、米曲菌米曲菌、青霉青霉 等真菌和等真菌和放线菌放线菌中，使之有普遍意义。中，使之有普遍意义。3 准性生殖的过程准性生殖的过程（1 1）菌丝联结（）菌丝联结（anastomosisanastomosis）;（2 2）形成异核体（形成异核体（heterocaryonheterocaryon）;细胞质、细胞核交流形成异核菌丝体。细胞质、细胞核交流形成异核菌丝体。（3 3）核配（）核配（caryogamy)caryogamy)形成杂合二倍体形成杂合二倍体;特点：频率低，特点：频率低，1010-5-51010-7-7 促成：樟脑熏蒸、紫外、高温。促成：樟脑熏蒸、紫外、高温。（4 4）体细胞交换和单倍体化）体细胞交换和单倍体化异核体异核体 同时具有二种或二种以上不同基因型核在同同时具有二种或二种以上不同基因型核在同一细胞质中，这种现象又叫异核现象。一细胞质中，这种现象又叫异核现象。同核体同核体 同一菌丝中只有一种核。同一菌丝中只有一种核。体细胞交换和单倍体化体细胞交换和单倍体化 体细胞交换：体细胞交换：杂合二倍体细胞中有极少数细胞核在进行杂合二倍体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂有丝分裂 的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离 （单倍体化单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子。）而产生具有新性状的单倍体杂合子。单倍体化单倍体化：在一系列有丝分裂过程中一再发生的个别染色体减在一系列有丝分裂过程中一再发生的个别染色体减 半，直至最后形成单倍体的过程。半，直至最后形成单倍体的过程。（三）酵母菌的接合型遗传（三）酵母菌的接合型遗传酵母菌以单倍体或二倍体的状态存在。酵母菌以单倍体或二倍体的状态存在。单倍体：单倍体：a细胞或细胞或细胞，细胞，或称或称a a接合型，接合型，接合型。接合型。二倍体：二倍体：a细胞和细胞和细胞融合形成二倍体细胞。细胞融合形成二倍体细胞。接合型遗传：接合型遗传：a细胞细胞 细胞的转变。细胞的转变。盒式机制转变盒式机制转变。启动子启动子沉默状态沉默状态沉默状态沉默状态a基因表达。基因表达。a型细胞。型细胞。盒式机制转变盒式机制转变在于在于 MAT活性区的调控作用活性区的调控作用第四节第四节 微生物育种微生物育种一一 诱变育种诱变育种二二 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选三三 原生质体融合原生质体融合一一 诱变育种诱变育种1 1、概念、概念2 2、诱变剂、诱变剂3.3.诱变程序诱变程序4 4、诱变的主要环节、诱变的主要环节1 1、概念、概念诱变育种诱变育种是用物理或化学的是用物理或化学的诱变剂诱变剂使诱变使诱变对象内的遗传物质（对象内的遗传物质（DNADNA）的分子结构发生的分子结构发生改变，引起改变，引起性状变异性状变异并通过并通过筛选筛选获得符合获得符合要求的要求的变异菌株变异菌株的一种育种方法。的一种育种方法。2 诱变剂诱变剂（1 1）概念概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。：凡能提高基因突变频率的理化因素。（2 2）种类种类：1 1）物理因子（物理因子（phisical agents)phisical agents)物理诱变剂：物理诱变剂：U.VU.V、快中子、超声波等。快中子、超声波等。2 2）化学因子化学因子(chemical agents)chemical agents)化学诱变剂化学诱变剂 碱基修饰剂碱基修饰剂 如如：羟胺、羟胺、氮芥、硫酸二乙酯（氮芥、硫酸二乙酯（DESDES）、）、亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）机制机制：对碱基做修饰，改变碱基的配对性质。：对碱基做修饰，改变碱基的配对性质。碱基类似物碱基类似物 如如：叠氮胸腺嘧啶（：叠氮胸腺嘧啶（AITAIT）、）、5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-5-UBUB）、2-2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2AP2AP）等。）等。机制机制：在：在DNADNA复制时将碱基类似物插入复制时将碱基类似物插入DNADNA中，而碱基中，而碱基 类似物存在正常状态和稀有状态的转变，在类似物存在正常状态和稀有状态的转变，在DNADNA 复制时出现突变体。复制时出现突变体。插入剂插入剂(intercalating agents):intercalating agents):如如：溴化乙锭、吖啶橙等一些：溴化乙锭、吖啶橙等一些三环分子三环分子。机制机制：在形态上类似于碱基对的扁平分子。它们插入：在形态上类似于碱基对的扁平分子。它们插入DNADNA分子的碱基对之间，使其分开，导致分子的碱基对之间，使其分开，导致DNADNA在复制过程在复制过程中的滑动，引起移码突变。中的滑动，引起移码突变。与胞嘧啶反应，加上羟基（与胞嘧啶反应，加上羟基（-OH-OH），对胞嘧啶加以），对胞嘧啶加以修饰。修饰后的胞嘧啶类似胸腺嘧啶修饰。修饰后的胞嘧啶类似胸腺嘧啶T T。C G 羟基化的胞嘧啶羟基化的胞嘧啶 A诱发诱发CG到到TA的的转换突变转换突变碱基修饰剂碱基修饰剂-羟胺羟胺碱基类似物碱基类似物5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5BU5BU）正常状态：正常状态：类似胸腺嘧啶，与腺嘌呤配对。类似胸腺嘧啶，与腺嘌呤配对。A 5BU A T下一轮下一轮复制复制稀有状态稀有状态：类似胞嘧啶，只与鸟嘌呤配对。类似胞嘧啶，只与鸟嘌呤配对。G 5BU G C下一轮下一轮复制复制正常状态和正常状态和稀有状态可稀有状态可以相互转换以相互转换B DNA分子吸收稀有状态的分子吸收稀有状态的5BU G 5BU A TDNA复制转换复制转换成正常状态成正常状态（G C）（取代（取代G C）A DNA分子吸收正常状态的分子吸收正常状态的5BU A 5BU G CDNA复制转换复制转换成稀有状态成稀有状态（A T）（取代（取代A T）碱基类似物碱基类似物5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5BU5BU）图示3 诱变程序诱变程序 原始菌种原始菌种 原菌种特性鉴定原菌种特性鉴定 纯化纯化 斜面斜面/肉汤肉汤 培养单孢子培养单孢子/单细胞悬液单细胞悬液 诱变剂处理诱变剂处理 计算存活率计算存活率 平板分离平板分离 观察形态变异，挑单菌落观察形态变异，挑单菌落 移至斜面移至斜面 初筛初筛 复筛复筛 小试小试 良种保藏良种保藏 中试中试4 诱变的主要环节诱变的主要环节（1）诱变剂的选择）诱变剂的选择（2）出发菌株的选择）出发菌株的选择（3）单孢子或单细胞悬液的制备单孢子或单细胞悬液的制备（4 4）设计和采用效率高的筛选方案和方法）设计和采用效率高的筛选方案和方法（1 1）诱变剂的选择：）诱变剂的选择：1 1）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。2 2）处理方式处理方式 单一因子处理：先后使用。单一因子处理：先后使用。复合因子处理：两种以上因素同时使用、单一复合因子处理：两种以上因素同时使用、单一 因子重复使用。因子重复使用。3 3）处理剂量：测致死率。处理剂量：测致死率。方法：平板菌落计数法方法：平板菌落计数法 一般杀菌率为一般杀菌率为70%70%左右。左右。（2 2）出发菌株：）出发菌株：育种的原始菌种应具备：育种的原始菌种应具备：对诱变剂的敏感性高；对诱变剂的敏感性高；生产中选育过的自发变异菌株；生产中选育过的自发变异菌株；本身具有一些有利性状；本身具有一些有利性状；对代谢产物有一定积累；对代谢产物有一定积累；已经发生过某些变异。已经发生过某些变异。（3 3）单孢子或单细胞悬液的制备）单孢子或单细胞悬液的制备 1 1）必要性）必要性：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不 纯的菌落纯的菌落菌种退化。菌种退化。2 2）制备）制备：物理诱变剂物理诱变剂生理盐水（生理盐水（0.85%0.85%NaCl)NaCl)化学诱变剂化学诱变剂缓冲液。缓冲液。3 3）方法）方法：三角瓶内加：三角瓶内加0.5cm0.5cm玻璃珠打散玻璃珠打散10-1510-15min;min;加加.3%.3%吐温吐温8080（表面活性剂，用无菌脱脂棉过（表面活性剂，用无菌脱脂棉过 滤）。滤）。4 4）浓度）浓度：细菌、放线菌：细菌、放线菌 10 108 8个个/ml ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 10 106 6个个/mlml （4 4）设计和采用效率高的筛选方案和方法）设计和采用效率高的筛选方案和方法 1 1）初筛）初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的 生理效应范围。生理效应范围。方法方法 梯度平板法（抗性菌株）梯度平板法（抗性菌株）纸片法（抗性菌株）纸片法（抗性菌株）透明圈法（淀粉酶产生菌株等）透明圈法（淀粉酶产生菌株等）变色圈法（氨基酸生产菌株）变色圈法（氨基酸生产菌株）2 2）复筛）复筛：较精确的生物化学分析方法较精确的生物化学分析方法做摇瓶测定做摇瓶测定 二二 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选（一）概念（一）概念（二）筛选方法（二）筛选方法（三）应用（三）应用 （一）（一）概念概念1.1.三种遗传型个体三种遗传型个体2 2、筛选用的培养基、筛选用的培养基 1 三种遗传型个体三种遗传型个体（1 1）营养缺陷型（）营养缺陷型（auxotrophauxotroph）：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养 基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：如：LysLys-;Bio;Bio-（2 2）野生型野生型(wild type)wild type)：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突 变前的原始菌株，为该微生物的野生型。变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：如：Lys+Lys+；Bio+Bio+（3 3）原养型原养型(prototroph)prototroph)：指指auxoauxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野 生型的表型相同。生型的表型相同。2 筛选用的培养基筛选用的培养基1 1）基本培养基（）基本培养基（minimal medium,MMminimal medium,MM）-：仅能满足野生型菌株营养要求的培养基。仅能满足野生型菌株营养要求的培养基。2 2）完全培养基（）完全培养基（complete medium,CMcomplete medium,CM）+：满足一切满足一切auxotrophauxotroph生长的天然或半组合培养基。生长的天然或半组合培养基。3 3）补充培养基（）补充培养基（supplemented medium,SMsupplemented medium,SM）x x：在在MMMM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相 应应auxotrophauxotroph生长的组合培养基。生长的组合培养基。（二）筛选方法（二）筛选方法auxotroph的筛选程序的筛选程序：筛选一般要经过筛选一般要经过诱变诱变、淘淘汰野生型汰野生型、检出检出和和鉴定鉴定营养缺陷型四个环节。营养缺陷型四个环节。细菌培养细菌培养 离心洗涤离心洗涤 诱变处理诱变处理 在在CMCM上培养上培养 洗涤洗涤 MMMM培养（加青霉培养（加青霉 素等筛选剂）素等筛选剂）涂布于涂布于CMCM平板平板 影印影印 培养培养 挑取挑取 鉴定鉴定 菌种保存。菌种保存。完全培养基完全培养基基本培养基基本培养基完全培养基完全培养基（三）（三）auxotroph的应用的应用（1 1）作为标记菌株）作为标记菌株：研究代谢、菌种杂交、重组育种和利用基因工研究代谢、菌种杂交、重组育种和利用基因工 程进行育种时带有特定基因标记的亲本菌。程进行育种时带有特定基因标记的亲本菌。（2 2）作为生产菌种）作为生产菌种：氨基酸、核苷酸等生产菌种；：氨基酸、核苷酸等生产菌种；（3 3）作为氨基酸、维生素、碱基等）作为氨基酸、维生素、碱基等物质生物测定的物质生物测定的 实验菌种。实验菌种。三三 原生质体融合原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）使遗传使遗传性状不同性状不同的的两两细胞的细胞的原生质体原生质体发生融发生融 合，并发生遗传重组以产生融合子（合，并发生遗传重组以产生融合子（fusantfusant）的过程。的过程。已成功地应用于真菌细胞和植物细胞的属间和已成功地应用于真菌细胞和植物细胞的属间和 科间的科间的远缘远缘细胞融合，细胞融合，融合产物含两亲代细胞融合产物含两亲代细胞 基因组。基因组。1 原生质体的制备原生质体的制备2 原生质体融合和再生原生质体融合和再生3 融合子的选择融合子的选择1 1 原生质体的制备原生质体的制备1）选择两个亲本菌株。）选择两个亲本菌株。细菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶。细菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶。2）酶处理破坏细胞壁，使原生质流出。）酶处理破坏细胞壁，使原生质流出。制备用培养基：高渗缓冲液或培养基。制备用培养基：高渗缓冲液或培养基。2 2 原生质体融合和再生原生质体融合和再生1）原生质体融合）原生质体融合 化学因子诱导化学因子诱导：聚乙二醇：聚乙二醇（polyethyeneglycol，PEG）并加入并加入Ca 2+、Mg 2+等阳离子等阳离子 电场诱导：电场诱导：电极极化原生质体成偶极子，沿电力线电极极化原生质体成偶极子，沿电力线 排列成串，电流脉冲，原生质体膜被击排列成串，电流脉冲，原生质体膜被击 穿，融合。穿，融合。2）原生质体再生）原生质体再生 在再生培养基上再生。在再生培养基上再生。再生率再生率0.几几%几几%.3 3 融合子的选择融合子的选择营养缺陷型标记选择营养缺陷型标记选择 依靠在选择培养基上的遗传标记，有两个依靠在选择培养基上的遗传标记，有两个遗传标记互补，可确定为融合子。遗传标记互补，可确定为融合子。抗药性标记。抗药性标记。第五节第五节 菌种的衰退、复壮及保藏菌种的衰退、复壮及保藏 一、菌种的衰退和复壮菌种的衰退和复壮 二、菌种保藏菌种保藏一、菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退和复壮（一）衰退衰退（二）防止衰退的方法防止衰退的方法（三）菌种的复壮菌种的复壮（一）衰退（一）衰退1 1、概念、概念：菌种经长期的人工：菌种经长期的人工培养或保藏培养或保藏,在其自在其自 发突变的影响下，引起某些发突变的影响下，引起某些优良性状优良性状 变弱或消失变弱或消失的现象，称为衰退。的现象，称为衰退。2 2、现象、现象 （1 1）菌落和细胞形态的改变；）菌落和细胞形态的改变；（2 2）生长速度缓慢，产孢子越来越少；