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第八章第八章病毒学研究方法简介病毒学研究方法简介生物安全实验室生物安全实验室P1实验室实验室研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松；带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松；P2实验室实验室研究的是中度危险的病原，像研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩；等等，要求戴防护性较好的口罩；P3实验室实验室研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多；实验室严密得多；P4实验室实验室全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。这种管子，然后才能呼吸。根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为级，根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为级，一级最低，四级最高。一级最低，四级最高。病毒学研究的主要方法病毒学研究的主要方法生物学特性测定生物学特性测定:在寄主上的反应在寄主上的反应症状、传播症状、传播等等病毒分离与培养病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况清的特异免疫吸附情况免疫学技术免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术分子生物学技术：核酸分子杂交、核酸分子杂交、PCR等等一、生物学特性测定一、生物学特性测定在寄主上的反应在寄主上的反应寄主范围、症状表现、传播方式寄主范围、症状表现、传播方式等等病毒的理化性质病毒的理化性质病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、体外存活期等体外存活期等病毒接种方法病毒接种方法注射接种、病毒组织培养技术注射接种、病毒组织培养技术植物病毒植物病毒汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁接接种、菟丝子接种法等接接种、菟丝子接种法等巨细胞病毒感染细胞的典型巨细胞病毒感染细胞的典型“猫头鹰眼猫头鹰眼”样核内包涵样核内包涵体体冠状病毒感染冠状病毒感染“非典非典”X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为双侧改变，阴影吸收消散较慢。双侧改变，阴影吸收消散较慢。TMV transmission by an Apis sp.A severe mosaic symptom on tomato leaf(TMV)腿色斑腿色斑Chloroticspoting黄化黄化Yellowing病毒检测病毒检测斑驳斑驳Mottle脉明症脉明症Vein-clearing条斑条斑Leafstreak腿色斑驳腿色斑驳Chloroticmottleyellowdwarf变色变色变色变色seedcoatmottling郁郁金金香香碎碎锦锦花花叶叶病病花变色花变色碎色症碎色症colorbreaking、花瓣变绿、花瓣变绿virescence杂色花郁金香、香石竹、紫罗兰、虞美人、唐菖蒲杂色花郁金香、香石竹、紫罗兰、虞美人、唐菖蒲TestingforSoybeanViruseswithIndicatorPlantsHypersensitivitySomeplantsarepredictablysensitivetoaspecificvirus.Thehypersensitiveplantsarecalledindicatorplants,andareusedasabioassaytotestforthepresenceofvirusinanunknownsample1Materials:gloves,sterilecottonswabs,rinsebottle,tissuegrindingbagsandcarborundum-siliconcarbidewhichisusedasatissueabrasive2Plantsapismadefromtheplanttobetestedforvirusbypullingoffasymptomaticupperleaf3placingtheleafinasterileplasticbag.addingbuffersolutiontothebag.grindtheleaftissuetoreleasethevirusparticlesintothebuffer.4sprinkleabitofcarborundumontheplanttobeinoculated.Justalightdustingissufficienttoprovideenoughabrasiontointroducevirusintotheplantcells.5inoculatetheindicatorplant,acottonswabisimmersedinplantsaprubthesurfaceofthetestplantleaffirmly,butnotwithenoughforcetoteartheleaf67rinseoffthecarborundumexcesssapfromtheleafwithwatertoremovecompoundsthatcouldinterferewiththeinfectionprocess8Theindicatorplantsareplacedinthegreenhouseandcheckeddailyforsymptoms.Ifcharacteristicsymptomsappear,weknowthatvirusparticleswerepresent卵黄囊接种：卵黄囊接种：用用58d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒羊膜腔：羊膜腔：用用1214d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离水检查。常用于流感病毒的初次分离尿囊腔：尿囊腔：用用912d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等绒膜尿囊膜：绒膜尿囊膜：用用1012d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料鸡胚，无菌下开一小窗，将材料滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病变。常用于变。常用于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒鸡胚接种鸡胚接种绒毛尿囊膜衰现痘病毒特异性损伤绒毛尿囊膜衰现痘病毒特异性损伤要证明某种疾病是某一感染因子所引起则必须满要证明某种疾病是某一感染因子所引起则必须满足足Rivers法则：法则：从患病者体内分离出病毒；从患病者体内分离出病毒；在实验动物或寄主细胞中可以培养；在实验动物或寄主细胞中可以培养；证明这种培养物具有滤过性；证明这种培养物具有滤过性；在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；能重新分离出病毒。能重新分离出病毒。病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。病毒分离病毒分离(virusisolation)是诊断病毒感染的是诊断病毒感染的“金标金标准准”(goldstandard)。二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养标本采集和运送标本采集和运送时间：时间：发病早期发病早期部位：部位：视发病规律和病程而定视发病规律和病程而定运送：运送：立即送检立即送检4保存或保存或-70（长期保存）（长期保存）不泄漏、传播、填写详细标签不泄漏、传播、填写详细标签分离与鉴定：分离与鉴定：二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养提纯提纯extraction/纯化纯化purification二元培养法二元培养法（一）病毒的纯化与提纯（一）病毒的纯化与提纯一般纯化方法一般纯化方法动物病毒的纯化：动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法从空斑、病斑分离，用终点稀释法植物病毒的纯化：植物病毒的纯化：如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上；接种到适当寄主上；如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养混合感染的病毒分离混合感染的病毒分离1、根据病毒的性状、选择、根据病毒的性状、选择不同的寄主不同的寄主或根据病毒钝或根据病毒钝化温度和稀释终点的差异，如：化温度和稀释终点的差异，如：PVX在千日红上引起局部病斑在千日红上引起局部病斑PVY在酸浆草上在酸浆草上形成局部病斑，蔓陀罗对形成局部病斑，蔓陀罗对PVY免疫免疫TMV钝化温度钝化温度90以上以上CMV钝化温度在钝化温度在6070（汁液接种前高温处理汁液接种前高温处理.)2、虫媒传染虫媒传染：PVX不可由虫媒传，不可由虫媒传，PVY可由桃蚜可由桃蚜传传 不同种的虫媒或获毒饲育时间和持久性的长短不同种的虫媒或获毒饲育时间和持久性的长短3、果树等果树等木本植物木本植物病毒，如找到病毒，如找到草本寄主草本寄主和传毒虫和传毒虫 媒可用草本寄主纯化、繁殖、分离媒可用草本寄主纯化、繁殖、分离二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养病毒纯化中的必要参考属性：病毒纯化中的必要参考属性：1.稀释限点稀释限点(dilutionendpoint,DEP)抽提液稀释到最后一个尚有侵染力的稀释度抽提液稀释到最后一个尚有侵染力的稀释度2.钝化温度钝化温度(thermalinactivationpoint,TIP)病毒在未加处理的抽提液中，在某一温度时暴露病毒在未加处理的抽提液中，在某一温度时暴露10min而达而达到完全钝化到完全钝化3.体外存活期体外存活期(L)病毒在抽提液中放在病毒在抽提液中放在2022条件下，能保持多少时条件下，能保持多少时间的侵染力。间的侵染力。4.沉降系数与分子量沉降系数与分子量沉降系数沉降系数S在在20下下1达因的引力场中的沉降的速度达因的引力场中的沉降的速度（cm/s)常用常用1000，植物病毒在，植物病毒在50几千几千S二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养（二）病毒提纯的原理（二）病毒提纯的原理1、破碎寄主细胞、破碎寄主细胞低速离心低速离心(100010000g，515min)去除较大的组去除较大的组分叶绿体、线粒体、淀粉颗粒、细胞壁碎片等，分叶绿体、线粒体、淀粉颗粒、细胞壁碎片等，中间组分如植物蛋白、核糖核蛋白体、微粒体中间组分如植物蛋白、核糖核蛋白体、微粒体(内内质网膜的小碎片质网膜的小碎片)等较难去除。等较难去除。2、提纯病毒的原理、提纯病毒的原理二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养（1）大多数病毒的外面主要由）大多数病毒的外面主要由蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质组成组成（2）病毒的大小、形状和密度适合在大约）病毒的大小、形状和密度适合在大约40000g重力重力重力重力下沉降下沉降常用试剂：常用试剂：1、适当的缓冲剂：、适当的缓冲剂：保护病毒，不变性保护病毒，不变性磷酸盐、硼酸盐、磷酸盐、硼酸盐、Tris-HCl等（种类、浓度）等（种类、浓度）2、还原剂：、还原剂：防止病毒因氧化而钝化、抑制酚氧化酶防止病毒因氧化而钝化、抑制酚氧化酶巯基乙醇巯基乙醇/酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸酸、亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸3、溶剂：、溶剂：蛋白质、脂类变性剂，使组织抽提液澄清蛋白质、脂类变性剂，使组织抽提液澄清正丁醇、氯仿、乙醚等正丁醇、氯仿、乙醚等4、鳌合剂：、鳌合剂：EDTA等等可除去寄主中的核粒，与二价阳离子结合防止病毒粒子团可除去寄主中的核粒，与二价阳离子结合防止病毒粒子团聚和多元酚氧化聚和多元酚氧化5、其他添加剂：、其他添加剂：活性碳、膨润土活性碳、膨润土吸附除去核粒和色素等吸附除去核粒和色素等（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养1、差速离心和密度梯度离心、差速离心和密度梯度离心差速离心：差速离心：交替使用高速和低速离心交替使用高速和低速离心高速离心（高速离心（4000080000g）使病毒沉淀，使病毒沉淀，取沉淀取沉淀低速离心（约低速离心（约4000g）仅去除大的细胞碎片等杂质，仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清取上清密度梯度离心：密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离流介质中的密度而获得分离蔗糖蔗糖10%40%CsCl等等（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养2、沉淀法、沉淀法简便快速但粗糙易变性简便快速但粗糙易变性盐析法盐析法硫酸铵浓度达硫酸铵浓度达3050%饱和度时多数病毒沉淀饱和度时多数病毒沉淀等电点沉淀等电点沉淀加醋酸或盐酸加醋酸或盐酸丙酮沉淀丙酮沉淀浓度达浓度达4070%聚乙二醇沉淀聚乙二醇沉淀浓度达浓度达48%乙醇沉淀乙醇沉淀浓度达浓度达20%沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸铵沉淀铵沉淀3、吸附法、吸附法磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素4、酶处理酶处理许多病毒抗许多病毒抗蛋白酶蛋白酶和和核酸酶核酸酶（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养5、有机溶剂萃取、有机溶剂萃取有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：要考虑病毒对有机溶剂的耐受性要考虑病毒对有机溶剂的耐受性（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术脂肪变性非病毒蛋白病毒水醇二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养6、电泳法、电泳法普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等7、柱层析法柱层析法吸吸附：用离子交换或吸附法附：用离子交换或吸附法分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱8、抗血清处理、抗血清处理针对寄主蛋白的血清来沉淀杂蛋白针对寄主蛋白的血清来沉淀杂蛋白加病毒的抗血清形成病毒加病毒的抗血清形成病毒抗体复合物抗体复合物（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法（四）植物病毒提纯举例（四）植物病毒提纯举例1PVX病植株汁液病植株汁液澄清的汁液澄清的汁液+饱和硫酸铵饱和硫酸铵2：1去上清，沉淀悬浮在去上清，沉淀悬浮在生理盐水或生理盐水或buffer静置静置30min11500g离心离心10min流水透析流水透析2h，buffer或或生理盐水透析生理盐水透析1夜夜3800g离心离心10min，去，去杂质杂质也可低速离心也可低速离心提纯的病毒悬液可直接使用，提纯的病毒悬液可直接使用，也可进一步重复沉淀提纯也可进一步重复沉淀提纯弃沉淀，上层即为弃沉淀，上层即为提纯的病毒悬液提纯的病毒悬液超速离心法超速离心法（四）植物病毒提纯举例（四）植物病毒提纯举例2CMV病叶病叶+buffer+巯基乙酸，匀浆巯基乙酸，匀浆500g离心离心15min，留，留上清液上清液80000g离心离心30min,留沉淀留沉淀+缓冲液缓冲液澄清液澄清液+聚乙二醇，聚乙二醇，溶解后静置溶解后静置30min（沉淀病毒）沉淀病毒）低速离心低速离心10min（5000g)保留上清液保留上清液超速离心超速离心150min(75000g)留沉淀，缓冲液悬浮留沉淀，缓冲液悬浮15000g离心离心20min,保留上清液保留上清液上清液即为提纯的病毒悬上清液即为提纯的病毒悬液，也液，也可可重复进一步提纯重复进一步提纯动物培养动物培养鸡胚培养鸡胚培养组织培养组织培养原代细胞：原代细胞：新鲜组织新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散胰蛋白酶消化，分散+培养液培养液成成单层细胞单层细胞二倍体细胞株二倍体细胞株：原代细胞传代（原代细胞传代（为二倍体细胞为二倍体细胞）传代细胞系传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体）（非整倍体）动物病毒的培养动物病毒的培养二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养病毒学研究的主要方法病毒学研究的主要方法生物学特性测定生物学特性测定:在寄主上的反应在寄主上的反应症状、传播症状、传播等等病毒分离与培养病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况清的特异免疫吸附情况免疫学技术免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术分子生物学技术：核酸分子杂交、核酸分子杂交、PCR等等标本制备标本制备浓缩标本有以下几种方法：浓缩标本有以下几种方法：超速离心超速离心离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是机转头的半径，一般是30min到到3h沉淀的样本用灭菌蒸沉淀的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上；馏水洗后再放到铜网上；超过滤法超过滤法用于分子筛的蛋白质相对分子质量为用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000；接种细胞接种细胞接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；免疫凝集免疫凝集如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒病毒三、病毒的光镜与电镜观察法三、病毒的光镜与电镜观察法光光光光 镜：寄主组织切片、包含体镜：寄主组织切片、包含体镜：寄主组织切片、包含体镜：寄主组织切片、包含体三、病毒的电镜观察法三、病毒的电镜观察法1、正染法（超薄切片法、病组织）、正染法（超薄切片法、病组织）将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常通常12d完成。完成。操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。程。2、负染法负染法直接将病毒悬液直接将病毒悬液(也可用细胞也可用细胞)滴在铜网上，用重金属滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。可出结果。原理：原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区显示亮区较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。缺点：缺点：敏感性低，要求病毒量在敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒难于鉴别。以上，同科病毒难于鉴别。3、投影技术、投影技术4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等等采用几种电镜技术观采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态察病毒粒子的形态Orfvirus：口疮病毒口疮病毒(接触性脓疱皮炎接触性脓疱皮炎)Ebolavirus埃博埃博拉病毒（正染技术）拉病毒（正染技术）Vacciniavirus痘苗病毒痘苗病毒（投影技术）（投影技术）负染技术负染技术美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩色电子显微照片。它显示出色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金型禽流感病毒（金黄色）在黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态细胞（绿色）培养液中的活动状态电镜技术的应用电镜技术的应用研究病毒形态、鉴定研究病毒形态、鉴定 观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改变；病毒的分类等。变；病毒的分类等。诊断病毒病诊断病毒病 检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、毒、嵌杯病毒、HAVHAV等都是用电镜最先发现的等都是用电镜最先发现的能能进一步发现新的病毒和病毒病。进一步发现新的病毒和病毒病。四、免疫学技术四、免疫学技术1、病毒抗原、病毒抗原2、病毒抗体、病毒抗体3、免疫学诊断方法、免疫学诊断方法免疫荧光法免疫荧光法(IF)免疫酶法（免疫酶法（ELISA）单克隆抗体技术单克隆抗体技术血凝抑制（血凝抑制（HI）试验）试验血凝试验血凝试验HA琼脂扩散试验琼脂扩散试验五、分子生物学技术五、分子生物学技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术PCRPCR技术技术基因检测技术的应用基因检测技术的应用本章要点本章要点病毒学研究的主要病毒学研究的主要技术与原理技术与原理