《让质粒鲜活起来》PPT课件.ppt

让质粒鲜活起来生物技术生物技术102102班班 第二小组第二小组成员：华璐、钟依依、苗舒、成员：华璐、钟依依、苗舒、庄思静、章辉辉庄思静、章辉辉Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design质粒的概念质粒是一类亚细胞有机体，结构比病毒还要简单，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外的生命周期，却能在宿主细胞中独立地增值，并随着宿主细胞的分裂而被遗传下去。PlasmidTankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design目录CONTENTS基本性质主要类型提取方法异同分析Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design质粒的基本性质质粒分子的构型多样、大小不一1 质粒的自主复制性和可扩增性2 质粒的可转移性3 质粒的不相容性4Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 质粒分子的构型多样、大小不一共价封闭环状DNA，即SC构型。开环DNA，称作OC构型。线形DNA，即L构型123除了除了酵母的杀伤质粒酵母的杀伤质粒是一种是一种RNARNA质粒质粒外，目前发现的质外，目前发现的质粒粒都是都是以以DNADNA方式存在的。方式存在的。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 质粒的自主复制性和可扩增性根据质粒复制与宿主菌相关程度不同，可将质粒根据质粒复制与宿主菌相关程度不同，可将质粒分为分为严谨型质粒严谨型质粒和和松弛型质粒松弛型质粒（常被选为基因工（常被选为基因工程载体）程载体）严谨型质粒通常是一些严谨型质粒通常是一些具有自身传递能力具有自身传递能力的的大质大质粒粒，其复制与宿主菌，其复制与宿主菌密切相关密切相关。松弛型质粒通常是松弛型质粒通常是分子量较小分子量较小，不具传递能力不具传递能力的的质粒，它在宿主菌内通常可含质粒，它在宿主菌内通常可含10-20010-200个拷贝，且个拷贝，且不受不受宿主菌蛋白合成的宿主菌蛋白合成的影响影响。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 质粒的可转移性质粒的可转移性是指质粒从一个细胞转移质粒的可转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。到另一个细胞的特性。根据是否携带控制细菌配对和质粒接合转根据是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，质粒可分为移的基因，质粒可分为接合型质粒接合型质粒和和非接非接合型质粒合型质粒两类。两类。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 质粒的不相容性质粒的不相容性有时也称质粒的质粒的不相容性有时也称质粒的不亲和不亲和性性，它是指在没有选择压力的情况下，它是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能不能在在同一个宿主细胞系中同一个宿主细胞系中稳定共存稳定共存的现象，的现象，这样的两种质粒称为不亲和质粒。这样的两种质粒称为不亲和质粒。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignNo.1No.1主要依赖天然存在的质粒主要依赖天然存在的质粒No.2No.2人工构建一批分子量相对较人工构建一批分子量相对较小、拷贝数较多、具特殊功小、拷贝数较多、具特殊功能的质粒载体能的质粒载体No.3No.3主要借助于一些辅助序列引主要借助于一些辅助序列引入新的功能入新的功能质粒研制与发展的三个阶段Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 常用的几种质粒pBR322pBR322质粒载体质粒载体 这是目前常规基因克隆实验中最普遍采用的载这是目前常规基因克隆实验中最普遍采用的载体，有体，有万能质粒万能质粒之称。之称。pUCpUC质粒载体质粒载体 它实际上是由它实际上是由pBR322pBR322质粒载体改造而来的一系质粒载体改造而来的一系列质粒载体的总称。它包括有列质粒载体的总称。它包括有pUC8pUC8、pUC9pUC9、pUC12pUC12、pUC13pUC13、pUC18pUC18等。等。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignPvu 2067pBR322质粒载体结构图 Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker DesignpUC18质粒载体结构图Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design pUC系列质粒载体的优点与与pBR322pBR322质粒载体相比，质粒载体相比，pUCpUC系列质粒载体具系列质粒载体具有许多有许多优越性优越性：（1 1）具有更小的分子量和更高拷贝数。）具有更小的分子量和更高拷贝数。（2 2）由于具有来自大肠杆菌）由于具有来自大肠杆菌laclac操纵子操纵子lacZlacZ的的基因，它所编码的基因，它所编码的肽链可参与肽链可参与互补作用，互补作用，可用于组织化学方法检测重组体。可用于组织化学方法检测重组体。（3 3）具有多克隆位点）具有多克隆位点MCSMCS区段。区段。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 质粒的提取 在提出的许多用于从细菌中提纯质粒在提出的许多用于从细菌中提纯质粒DNADNA的的方法中都含有以下方法中都含有以下3 3个步骤个步骤:（1 1）细菌培养物的生长。）细菌培养物的生长。（2 2）细菌的收获和裂解）细菌的收获和裂解 （3 3）质粒）质粒DNADNA的纯化。的纯化。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 提取的方法 质粒质粒DNADNA的提取方法主要有的提取方法主要有：碱裂解法碱裂解法（此方法适用于（此方法适用于小量质粒小量质粒DNADNA的提的提取，提取的质粒取，提取的质粒DNADNA可可直接用于直接用于酶切、酶切、PCRPCR扩增、银染序列分析）扩增、银染序列分析）煮沸法煮沸法酚氯仿裂解法。酚氯仿裂解法。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design碱裂解法1.1.接接1%1%含质粒的大肠杆菌细胞于含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB2ml LB培养基。培养基。2.372.37振荡培养过夜。振荡培养过夜。3.3.取取1.5ml1.5ml菌体于菌体于EpEp管，以管，以4000rpm4000rpm离心离心3min3min，弃上清，弃上清液。液。4.4.加加0.lml0.lml溶液溶液I I(1(1葡萄糖，葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.050mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。充分混合。5.5.加入加入0.2ml0.2ml溶液溶液 II II(0.2 mM/L NaOH(0.2 mM/L NaOH，1 1 SDS)SDS)，轻，轻轻翻转混匀，置于冰浴轻翻转混匀，置于冰浴5 min 5 min。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design6.6.加入加入0.15m10.15m1预冷预冷溶液溶液IIIIII(5 mol/L KAc(5 mol/L KAc，pH4.8)pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 5 min。7.7.以以1010，000rpm000rpm离心离心20min20min，取上清液于另一新，取上清液于另一新EpEp管管8.8.加入加入等体积等体积的的异戊醇异戊醇，混匀后于，混匀后于00静置静置10min10min。9.9.再以再以1010，000rpm000rpm离心离心20min20min，弃上清。，弃上清。10.10.用用7070乙醇乙醇0.5ml0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。洗涤一次，抽干所有液体。11.11.待沉淀干燥后，溶于待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE0.05mlTE缓冲液中缓冲液中Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design 相关试剂的作用（一）（一）溶液溶液I I，50 mM50 mM葡萄糖葡萄糖/25 mM Tris-Cl /25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA/10 mM EDTA，pH 8.0pH 8.0 主要作用主要作用是：调节反应液是：调节反应液pHpH，使大肠杆菌悬，使大肠杆菌悬浮于反应液中，螯合浮于反应液中，螯合Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+等二价金属等二价金属离子。离子。（二）（二）溶液溶液IIII，0.2 N NaOH/1%SDS0.2 N NaOH/1%SDS 主要作用主要作用是：两者共同作用，使细胞溶解是：两者共同作用，使细胞溶解（其中（其中NaOHNaOH为主为主，SDSSDS为辅为辅）。）。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design（三）（三）溶液溶液IIIIII，3 M 3 M 醋酸钾醋酸钾/2 M /2 M 醋酸醋酸 主要作用主要作用是：使钾离子置换是：使钾离子置换SDSSDS中的钠离子而形成不溶中的钠离子而形成不溶性的性的PDSPDS，同时高浓度的盐，使得沉淀更加完全。，同时高浓度的盐，使得沉淀更加完全。（四）（四）异戊醇异戊醇 主要作用主要作用是：为了让离心后上下层的界面更加清晰，是：为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。也方便了水相的回收。（五）（五）乙醇乙醇 主要作用主要作用是：进一步沉淀质粒是：进一步沉淀质粒DNADNA，去除残留的盐。，去除残留的盐。Tankertanker DesignTankertanker DesignTankertanker Design质粒提取质粒提取基因组提取基因组提取提取提取步骤基本上步骤基本上都属都属DNADNA的提取的提取步骤，包括步骤，包括细胞裂解，细胞裂解，DNADNA释放，纯化，最后沉淀溶解释放，纯化，最后沉淀溶解提取中有一个提取中有一个DNADNA变变性、复性的过程，整性、复性的过程，整个过程较为个过程较为简单简单，用用时短时短。没有没有DNADNA变性、复性变性、复性的过程，对有些革兰的过程，对有些革兰氏阳性菌要进行溶菌氏阳性菌要进行溶菌酶处理，整个酶处理，整个过程更过程更复杂复杂，耗时更长耗时更长。与基因组提取的异同Thank you!