Westernblot实验原理和实验步骤.ppt

Western blotting基本原理和实验步骤为什么要做蛋白质印迹实验？为什么要做蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。目 录 1Western blot 基本原理 2蛋白免疫印迹的组成 3Western blot 一般流程 4Western blot 常见问题分析1Western BlotWestern Blot基本原理基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体例如PVDF膜上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。2组成成蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。n第一步:是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。n第二步：把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，电转移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式两种。n第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。3Western blot 流程图Western Blot一般流程1蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l洗膜l二抗杂交l洗膜l底物显色蛋白样品的制备21、细胞的处理：1、细胞计数，取5*104/well，500g离心5min。加入200ul PBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ul PBS 再加入5ul 5Xloading buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。2、分泌蛋白的提取：取15ul细胞上清，加入5ul 5Xloading buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳4分离胶浓度与蛋白分离范围5制胶1）装好架子，固定好玻璃板。2）注水试漏。3）倒 水，甩 干，用 滤 纸 吸 净 残 留 水 份。4)按照下面配方配制12%分离胶。一般1.5玻璃板需胶6.5-7ml，1.0玻璃板需胶4.5ml。5)将胶慢慢倒入，防止有气泡产生。6）在胶上面加入一层蒸馏水，可以将胶里的气泡压出、将胶面压平并防止顶层胶风干。7)待分离胶凝集后（至少20度，30min），配制浓缩胶5。6制胶过程注意事项操作时要使两玻璃对其，以免漏胶加完分离胶后，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。插梳子时要使梳子保持水平。7上样与电泳将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。浓缩胶用70V电压，当样品至分离胶时，用120V电压，至溴酚兰跑到底时停止电泳。电泳时常遇到的问题 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。8转膜在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。槽式湿转法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。-/海绵/滤纸/胶/膜/滤纸/海绵/+半干转移法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。-/滤纸/胶/膜/滤纸/+910半干转移步骤（1）从阳极（下）到阴极（上）方向依次：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸，呈三明治样。在加有转膜液的盘里放入转膜用的夹子、滤纸和浸过的膜。（2）将阳极（下）打开使保持水平。在上面垫两张厚滤纸，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（3）轻轻将小玻璃板撬掉，再将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶，并根据胶的大小裁剪同样大小PVDF膜，剪去膜的左上角作为标记。如果样本多，同时做几张膜，可用铅笔在膜下角标ABCD或1234，这样可以分出膜的正反和加样顺序。注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将裁好的PVDF膜置于甲醇中浸2min才可使用。（4）先把PVDF膜盖在2层滤纸并除去气泡,再把胶盖在膜上，最后盖上另2张滤纸，擀几下盖上阴极盖子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。（5）将盒子放入转膜槽中，转膜时会产热，打开电源，设置mA 和时间转膜时间。转膜条件推荐：25V，1.0A，25min。（适合本实验室半干转移条件）转膜注意事项：滤纸、胶、膜之间不能有气泡产生滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润111、封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。2、常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。3、在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，4C过夜。4、封闭后可以不洗膜，让膜的一角在吸水纸上接触，把封闭液控一下即可5、Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。12封闭1、先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。2、配好1%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。3、将稀释好的抗体和膜一起放在密闭的自封袋或抗体盒中，100rpm摇动孵育。一般采用RT 1小时。洗洗膜膜 用 TBST摇动洗三次，每次10min。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。12一抗杂交13二抗杂交1、将PVDF膜放在密闭的自封袋或抗体盒中，加入稀释好的荧光二抗，孵育 RT 0.5小时。（一般采用HRP标记的二抗，稀释比例参照说明书）注：二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。洗膜去掉二抗稀释液，加入TBST液，在测摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10min。吸尽洗涤液后再加入洗涤液洗涤5-10min。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。1、用平头镊子取出膜，放入已配制好的BeyoECL Star工作液中（BeyoECL Star 工作液应提前取出放置室温）放置1-2min。2、取膜，弃去BeyoECL Star 工作液，将膜放置在自封袋中间，随后进行凝胶成像仪发光检测。14底物显色：化学发光法（ECL）4Western blot 常见问题分析可能遇到的问题及解决途径（1）没有特异蛋白带出现：检查蛋白样品是否降解；丽春红对膜染色，查看转印效果；逐一验证所用抗体的有效性；检查显色体系。（2）非特异条带出现：封闭不好抗体浓度过大，适当减少抗体用量；抗体特异性不好。（3）整张膜背景深：封闭不好抗体浓度过大，适当减少抗体用量，膜在实验过程中干过。（4）条带弥散：电泳分离效果不好，可能是胶凝得不充分；电流不稳定也有可能导致条带不均匀。（5）结果中无信号或显示信号弱：检测样本不表达目的蛋白检测样本低表达目的蛋白转移不完全或过转移抗体不能识别测试种属的相关蛋白二抗与一抗不匹配洗膜过度1其他现象1）膜上多处出现黑点或黑斑原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。2）蛋白分子量偏低或偏高原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。1注意事项1）电泳加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。2）为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。3）样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解。4)为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。5)上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。6）取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对pvdf膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。7)转膜时，一定要将三明治各层之间的气泡赶干净，否则转膜时产热量会很大，很影响转膜效率。8）转膜完，可以通过预染marker看看转膜的情况。有没有转过了穿到膜后的滤纸上，或者还有部分残留在胶上。以便下次调整转膜时间和电压。9）二抗浓度不宜太高否则会导致背景过高。THANKS