《生物化学》本科课件：第一章蛋白质的结构与功能.ppt

目录目录生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学目录目录第五节第五节蛋白质的分离纯化与结构分析蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein目录目录一、一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物小分子化合物应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。的目的。n透析透析(dialysis)n超滤法超滤法利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法物分开的方法。目录目录二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质浓缩方法的蛋白质浓缩方法使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。也可用乙醇沉淀。盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。目录目录免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。目录目录三、利用荷电性质可电泳分离蛋白质三、利用荷电性质可电泳分离蛋白质蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pIpI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质质的的技技术术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。根根据据支支撑撑物物的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶胶电泳等。电泳等。目录目录SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子，常用于蛋白质分子量的测定。量的测定。等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。n几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳:目录目录四、四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离进行层析分离待待分分离离蛋蛋白白质质溶溶液液（流流动动相相）经经过过一一个个固固态态物物质质（固固定定相相）时时，根根据据溶溶液液中中待待分分离离的的蛋蛋白白质质颗颗粒粒大大小小、电电荷荷多多少少及及亲亲和和力力等等，使使待待分分离离的的蛋蛋白白质质组组分分在在两两相相中中反反复复分分配配，并并以以不不同同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。n层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理目录目录离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析又称分子筛层析，利，利用各蛋白质分子大小不同分离。用各蛋白质分子大小不同分离。n蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法目录目录目录目录目录目录五、五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离可进行超速离心分离超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示，沉表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关降系数与蛋白质的密度和形状相关。目录目录因因为为沉沉降降系系数数S大大体体上上和和分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量，但但对对分分子子形形状状的的高高度度不不对对称称的的大大多多数数纤纤维状蛋白质不适用。维状蛋白质不适用。目录目录六、应用化学或反向遗传学方法可分析六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。目录目录n通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列目录目录离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分 人血红蛋白双向肽图人血红蛋白双向肽图 肽的氨基酸末端测定法肽的氨基酸末端测定法 目录目录七、应用物理学、生物信息学原理七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定可进行蛋白质空间结构测定n二级结构测定二级结构测定通通常常采采用用圆圆二二色色光光谱谱(circular dichroism，CD)测测定定溶溶液液状状态态下下的的蛋蛋白白质质二二级级结结构构含含量量。-螺螺旋旋的的CDCD峰峰有有222nm222nm处处的的负负峰峰、208nm208nm处处的的负负峰峰和和198 198 nmnm处处的的正正峰峰三三个个成成分分；而而-折折叠叠的的CDCD谱不很固定。谱不很固定。目录目录n三级结构测定三级结构测定X射射线线衍衍射射法法(X-ray diffraction)和和核核磁磁共共振振技技术术(nuclear magnetic resonance,NMR)是是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。目录目录同源模建同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐质序列对齐补偿氨基酸替补、插入和缺失补偿氨基酸替补、插入和缺失通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。序列相似性越高，预测的模型也越准确。折叠识别折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。结构。从无到有从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。结构。n根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：