生化分离技术和生物化工产品.ppt

第九章第九章生化分离技术和生物化工产品生化分离技术和生物化工产品2/19/20231基本定义基本定义l生化分离工程的定义：生化分离工程的定义：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程取、分离纯化、富集生物产品的过程(DownstreamProcessing)。l单元操作：单元操作：完成一道工序所需的一种方法和手段。完成一道工序所需的一种方法和手段。2/19/20232生化产品的类型生化产品的类型按用途分类按用途分类食品类。食品类。保健品类。保健品类。医用类产品（医用类产品（1998年，年，719种）。抗生素种）。抗生素112种种农业用产品（农业用产品（1998年，年，36种）。种）。生物试剂类（生物试剂类（1998年，年，975种）。种）。按分子量大小分类按分子量大小分类Mass1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类按发酵时目的产物所在的位置分类按发酵时目的产物所在的位置分类cell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）等淀粉酶）等2/19/20233生化产品的特点生化产品的特点1)、应用面广。、应用面广。医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等2)、种类繁多。分子量、种类繁多。分子量X0X000000，结构功能复杂，生物活性各异。，结构功能复杂，生物活性各异。3)、目的产物在初始物料中的含量低。、目的产物在初始物料中的含量低。青霉素（青霉素（4.2%）、庆大霉素）、庆大霉素（0.2%）、干扰素（）、干扰素（50ug/ml）。）。4)、产品价格与产物浓度呈反比、产品价格与产物浓度呈反比:5)、初初始始物物料料成成分分复复杂杂。除除少少量量产产物物外外，还还有有大大量量的的细细胞胞及及碎碎片片、其其他他代代谢谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。6)、生生物物活活性性物物质质的的稳稳定定性性低低。易易变变质质、易易失失活活、易易变变性性，对对温温度度、pH值值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。7)、产产品品的的质质量量要要求求高高，尤尤其其是是药药品品等等。成成品品青青霉霉素素对对其其强强致致敏敏原原青青霉霉噻噻唑唑蛋蛋白白必必须须控控制制RIA值值（放放射射免免疫疫测测定定）小小于于100（1.510-6），蛋蛋白白类类药药物物（杂杂质质2%）、重重组组胰胰岛岛素素（Humulin）中中杂杂蛋蛋白白小小于于0.01%。2/19/202341)、生化产品的必经的过程。、生化产品的必经的过程。2)、回收率不高。抗生素、回收率不高。抗生素(80%左右左右)，蛋白质，蛋白质(60-90%)。3)、分分离离纯纯化化昂昂贵贵。下下游游研研究究费费用用占占整整个个R&D费费用用的的50%以以上上；产产品品的的成成本本构构成成中中分分离离纯纯化化的的成成本本站站全全部部成成本本的的40-80%;精细和药用产品的成本比率更高精细和药用产品的成本比率更高;大多数酶大多数酶70%。4)、基基因因工工程程的的R&D费费用用，下下游游占占50-80%。基基因因工工程程表表达达产产品品成成本本85-90%；劳劳动动力力和和物物力力成成本本占占整整个个劳劳动动力力的的70-90%。5)、中中药药现现代代化化的的重重要要技技术术平平台台。农农学学、分分离离科科学学、生生化化分分析析、药学等药学等6)、提提供供产产品品竞竞争争力力的的关关键键技技术术之之一一。WTO，降降低低生生产产成成本本、提高产品标准。提高产品标准。7)、环境污染的治理、环境污染的治理。生化分离工作的重要性2/19/20235生化分离工作的一般过程生化分离工作的一般过程动、植物组织、体液等动、植物组织、体液等胞外产物胞外产物提取提取发酵液发酵液预处理预处理c分离分离c破碎破碎碎片分离碎片分离初步纯化初步纯化精制精制制成品制成品培养液培养液 加加 热热 沉沉 淀淀 匀匀 化化 离离 心心 沉沉 淀淀 分子筛分子筛 无菌过滤无菌过滤酶反应酶反应 调调 pH pH 离离 心心 超超 声声 萃萃 取取 吸吸 附附 离离 子子 超超 滤滤 絮絮 凝凝 过过 滤滤 胞胞 溶溶 过过 滤滤 萃萃 取取 亲亲 和和 冻冻 干干 错流过滤错流过滤 研研 磨磨 错流过滤错流过滤 超超 滤滤 吸吸 附附 喷喷 干干 憎憎 水水 结结 晶晶 电电 泳泳2/19/20236生化分离工程的分类生化分离工程的分类Absorbance1）、）、非特异性吸附非特异性吸附抗生素抗生素(吸附吸附)2）、）、特异性吸附特异性吸附抗体抗体2h3）、）、亲和吸附亲和吸附抗原抗体抗原抗体4）、）、离子交换离子交换抗生素抗生素Chromatography1）、）、凝胶凝胶抗生素、蛋白质抗生素、蛋白质(色谱或层析色谱或层析)2）、）、亲和色谱亲和色谱抗体抗体6h3）、）、离子交换离子交换蛋白质蛋白质ElectricField1）、磁性免疫微球）、磁性免疫微球抗原抗体抗原抗体(场致分离场致分离)2）、）、区带电泳区带电泳蛋白质蛋白质6h3）、）、等速电泳等速电泳蛋白类蛋白类4）、）、等点聚焦电泳等点聚焦电泳蛋白类蛋白类2/19/20237 预处理的目的预处理的目的:l改改变变发发酵酵液液的的物物理理性性质质(黏黏度度、颗颗粒粒、颗颗粒粒稳稳定定性性等等)，固液分离速度固液分离速度，分离器分离效率，分离器分离效率；l目标产物转移其中一相目标产物转移其中一相(多数为液相多数为液相)；l去杂质去杂质预处理方法预处理方法l加加热热：最最简简单单和和最最廉廉价价的的处处理理方方法法。黏黏度度、促促凝凝聚聚、固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白l调调pH值：方法简单有效、成本低廉；值：方法简单有效、成本低廉；l凝凝聚聚：在在凝凝聚聚剂剂(如如铝铝盐盐、铁铁盐盐、石石灰灰和和NaCl)作作用用下下,细细胞胞蛋蛋白白质质等等(准准)胶胶体体去去稳稳定定，并并聚聚集集成成1mm大大小小的的凝聚块的过程。凝聚块的过程。悬浮液的预处理悬浮液的预处理2/19/202382/19/202392/19/202310方法选择的基本原则方法选择的基本原则1)、尽可能简单、低耗、高效、快速。、尽可能简单、低耗、高效、快速。2)、分离步骤尽可能少、分离步骤尽可能少。Why?A)、n-总总回回收收率率，n-各各单单元元回回收率。收率。分分离离步步骤骤越越多多，回回收收率率越越低低；如如10=0.9510=0.63，5=0.955=0.77B)、分分离离步步骤骤多多，设设备备投投入入大大，人人员员物物资资消消耗耗大大，生生产周期长。产周期长。3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现。避免相同原理的分离技术多次重复出现。比比如如，分分子子筛筛和和超超滤滤技技术术按按分分子子量量大大小小分分离离，重重复复应应用两次以上，意义就不大了。用两次以上，意义就不大了。2/19/2023114)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。尽量减少新化合物进入待分离的溶液。A)、引起新的化学污染；、引起新的化学污染；B)、蛋白质的变性失活、蛋白质的变性失活5)、合理的分离步骤次序。合理的分离步骤次序。原原则则是是：先先低低选选择择性性，后后高高选选择择性性；先先高高通通量量，后后低低通通量量；先先粗粗分分，后后精精分分；先先低低成成本本，后高成本。后高成本。2/19/202312设计前应了解的信息设计前应了解的信息在设计前，首先要掌握的产物物化性质，在设计前，首先要掌握的产物物化性质，主要包括：主要包括：(1)、溶解度及影响因素，包括温度、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等；值、有机溶剂和盐等；(2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义；、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义；(3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义；、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义；(4)、极性大小；、极性大小；(5)、分子电荷及影响因素，包括、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等；值和盐等；(6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据；、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据；(7)、免疫原性。设计亲和色谱；、免疫原性。设计亲和色谱；(8)、稳稳定定性性及及其其影影响响因因素素，包包括括温温度度、pH值值、毒毒性性试试剂剂等等(如如青青霉霉素低素低pH不稳定不稳定)；(9)、等电点、等电点pI；2/19/202313成品规格（或产品质量标准）成品规格（或产品质量标准）表表1.3五肽胃泌素的上海市药品标准（五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版年版32页）页）指标名称指标名称指标指标含量（含量（C37H49N7O9S）97.0比旋光度比旋光度-25-29吸收值比吸收值比氨基酸氨基酸各氨基酸之比为各氨基酸之比为1干燥失重，干燥失重，%0.5进料的组成和物性进料的组成和物性(1)、目的产物的浓度。高？低？、目的产物的浓度。高？低？(2)、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。(3)、目的产物的定位。是胞内还是胞外？、目的产物的定位。是胞内还是胞外？(4)、菌种的种类和形态。、菌种的种类和形态。(5)、微生物的含量和发酵液的黏度。、微生物的含量和发酵液的黏度。2/19/202314生产规模生产规模危害性危害性(1)、离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘、离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。等。(2)、目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类、目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗生素，激素类药物等。抗生素，激素类药物等。(3)、试剂危害。萃取试剂、试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(4)、微微生生物物的的危危害害。重重组组DNA工工程程菌菌不不能能任任意意排排放放。这这一一菌菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。分批分离还是连续纯化分批分离还是连续纯化2/19/202315