《酶学基础三》PPT课件.ppt

酶学基础（三）酶学基础（三）1.1.5 酶促反应的机制酶促反应的机制1.酶底物复合物的形成酶底物复合物的形成(1)(1)中间产物学说：中间产物学说：E+S ES E+P(2)酶与底物结合特点：酶与底物结合特点：1）可逆的、非共价的结合；）可逆的、非共价的结合；2）底物只与酶的活性中心结合；）底物只与酶的活性中心结合；3）酶与底物结合是通过一种称为诱导契）酶与底物结合是通过一种称为诱导契合模式进行的。合模式进行的。k1 k-1k2 酶促反应：酶促反应：酶促反应：酶促反应：E+S =ES E+S =ES E+S =ES E+S =ES EP EP EP EP E+P E+P E+P E+P 反应方向反应方向反应方向反应方向,即化学平衡方向即化学平衡方向即化学平衡方向即化学平衡方向,主要取决于反应主要取决于反应主要取决于反应主要取决于反应自由能变化自由能变化自由能变化自由能变化 H H H H 。而反应速度快慢而反应速度快慢而反应速度快慢而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能则主要取决于反应的活化能则主要取决于反应的活化能则主要取决于反应的活化能EaEaEaEa。催化剂的作用是降低反应活化能催化剂的作用是降低反应活化能催化剂的作用是降低反应活化能催化剂的作用是降低反应活化能EaEaEaEa,从而起到从而起到从而起到从而起到提高反应速度的作用提高反应速度的作用提高反应速度的作用提高反应速度的作用2.2.活化能降低活化能降低活化能活化能：在一定温在一定温度下，度下，1mol1mol底物底物全部进入全部进入活化状态活化状态所需的自所需的自由能，单由能，单位位J/molJ/mol。E+SP+EES能能量量水水平平反应过程反应过程 G E1 E2S 酶催化作用的本质是酶的活性中心与底酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力物分子通过短程非共价力(如氢键如氢键,离子离子键和疏水键等键和疏水键等)的作用，形成的作用，形成E-SE-S反应中反应中间物。间物。其结果使底物的价键状态发生形变或极其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。化能作用。3 3、影响酶催化的有关因素、影响酶催化的有关因素(1)(1)底物与酶的靠近及定向底物与酶的靠近及定向(2)(2)“张力张力”和和“形变形变”(3)(3)酸碱催化酸碱催化(4)(4)共价催化共价催化(5)(5)金属离子催化作用金属离子催化作用 在酶促反应中，底物分子结合到酶的活在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。点。3 3、影响酶催化的有关因素、影响酶催化的有关因素(1)(1)底物与酶的靠近及定向底物与酶的靠近及定向临近效应临近效应定向效应定向效应(2)(2)“张力张力”和和“形变形变”底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力张力”甚至甚至“形变形变”，从而促使酶底物中间产物，从而促使酶底物中间产物进入过渡态进入过渡态。(3)(3)酸碱催化：酸碱催化：一般都是广义的酸碱催化方式。一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子供部分质子,或是通过质子碱接受部分或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的质子的作用，达到降低反应活化能的过程。过程。广义氢的供体广义氢的供体广义氢的受体广义氢的受体组氨酸的咪唑基：组氨酸的咪唑基：（1 1）pI pI值约为，在接近中性的条件下，值约为，在接近中性的条件下，一半以广义酸的形式存在，另一半以广一半以广义酸的形式存在，另一半以广义碱的形式存在，因而它既能作为质子义碱的形式存在，因而它既能作为质子供体，又能作为质子受体，有效地进行供体，又能作为质子受体，有效地进行酸碱催化。酸碱催化。（2 2）咪唑基供出和接受质子的速度很）咪唑基供出和接受质子的速度很快，其半衰期短，小于快，其半衰期短，小于0.10.1毫微秒。所毫微秒。所以许多酶活性中心都有组氨酸残基。以许多酶活性中心都有组氨酸残基。酶分子中可作为酸碱催化的功能基团酶分子中可作为酸碱催化的功能基团(4)(4)共价催化共价催化 某些酶在催化过程中，能通过共价某些酶在催化过程中，能通过共价键与底物结合成不稳定的酶键与底物结合成不稳定的酶-底物复合底物复合物，这个中间产物很容易变成过渡中物，这个中间产物很容易变成过渡中间物，反应的活化能大大降低。间物，反应的活化能大大降低。1 1）亲核催化）亲核催化 指酶分子中具有非共用电子对的指酶分子中具有非共用电子对的亲核基团攻击底物分子中具有部分正亲核基团攻击底物分子中具有部分正电性的原子，并与之作用形成共价键电性的原子，并与之作用形成共价键而产生不稳定的过渡态复合物，活化而产生不稳定的过渡态复合物，活化能降低。能降低。2 2）亲电催化）亲电催化亲电基团亲电基团：ZnZn2+2+、FeFe3+3+、MgMg2+2+等等(5)(5)金属离子催化作用金属离子催化作用 金属离子可以和水分子的金属离子可以和水分子的OH-OH-结合，使水结合，使水显示出更大的亲核催化性能。显示出更大的亲核催化性能。提高水的亲核性能提高水的亲核性能 电荷屏蔽作用电荷屏蔽作用v电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。多种激酶多种激酶(如磷酸转移酶如磷酸转移酶)的底物是的底物是MgMg2+2+-ATP-ATP复合物。复合物。1.1.6.1.1.6.酶催化机理的实例酶催化机理的实例(一一)E)E的特点的特点胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶:(EC3.4.4.5):(EC3.4.4.5)1.2411.241个个AAAA残基组成，分子量残基组成，分子量25000250002.2.专一性专一性AAAAAAAAAAAAAAAA1 1 AA AA2 2AAAAAAAAAA AA N N端端 芳香族芳香族AA CAA C端端3.3.活性中心活性中心Ser195,His57,Asp102Ser195,His57,Asp102，构成一个氢键，构成一个氢键 体系体系,His57,His57成为桥梁。成为桥梁。（二）作用机理（二）作用机理1.1.通过电荷转移，使通过电荷转移，使SerSer有更强的亲核力；有更强的亲核力；2.2.放出产物放出产物P P1,N1,N末端末端；3.3.形成产物形成产物P P2 2，C C 末端末端；底物底物结合底物结合底物形形成成共共价价ES复复合合物物His57 质子供体质子供体C-N键断裂键断裂R-NH2氨基产氨基产物释放物释放水水亲亲核核攻攻击击H2O四面体中间四面体中间物的瓦解物的瓦解羧基产羧基产物释放物释放胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶催化反应酶催化反应的详细机制的详细机制 1 1 1 1、酶催化反应只能得到一种构型（酶催化反应只能得到一种构型（酶催化反应只能得到一种构型（酶催化反应只能得到一种构型（L-L-L-L-型或型或型或型或D-D-D-D-型）型）型）型）的光学产物；的光学产物；的光学产物；的光学产物；2 2 2 2、酶酶酶酶常常常常常常常常存存存存在在在在着着着着底底底底物物物物或或或或产产产产物物物物抑抑抑抑制制制制现现现现象象象象，造造造造成成成成反反反反应应应应转化率降低，生产能力低等问题；转化率降低，生产能力低等问题；转化率降低，生产能力低等问题；转化率降低，生产能力低等问题；3 3 3 3、极极极极端端端端的的的的pHpHpHpH、较较较较高高高高的的的的温温温温度度度度和和和和高高高高盐盐盐盐浓浓浓浓度度度度的的的的反反反反应应应应体体体体系系系系都可能使酶钝化，失去部分甚至大部分催化活性；都可能使酶钝化，失去部分甚至大部分催化活性；都可能使酶钝化，失去部分甚至大部分催化活性；都可能使酶钝化，失去部分甚至大部分催化活性；4 4 4 4、大大大大量量量量的的的的氧氧氧氧化化化化还还还还原原原原酶酶酶酶、转转转转氨氨氨氨酶酶酶酶等等等等需需需需要要要要等等等等计计计计量量量量反反反反应应应应物物物物的的的的辅辅辅辅因因因因子子子子存存存存在在在在才才才才能能能能表表表表现现现现催催催催化化化化活活活活性性性性，从从从从而而而而限限限限制制制制了了了了它们在许多有机合成反应中的应用；它们在许多有机合成反应中的应用；它们在许多有机合成反应中的应用；它们在许多有机合成反应中的应用；5 5 5 5、酶酶酶酶通通通通常常常常在在在在水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中实实实实施施施施其其其其催催催催化化化化活活活活性性性性，对对对对于于于于大大大大多多多多数数数数有有有有机机机机化化化化学学学学反反反反应应应应来来来来说说说说，使使使使用用用用的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂是是是是非非非非水水水水溶溶溶溶性性性性的的的的有机溶剂。有机溶剂。有机溶剂。有机溶剂。后续酶催化反应的某些缺点后续酶催化反应的某些缺点 1.3.1.3.酶活力的概念及其测定酶活力的概念及其测定（一）酶活力的概念及表示方法（一）酶活力的概念及表示方法1.1.概念：概念：检测酶含量及存在，很难直接用检测酶含量及存在，很难直接用酶的酶的“量量”（质量、体积、浓度）来（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。化的化学反应的速度来确定。活活力力单单位位：规规定定条条件件（最最适适条条件件）下下，一一定定时时间间内内催催化化完完成成一一定定化化学学反反应应量量所所需需的酶量。的酶量。国国际际单单位位（U U）:指指在在最最适适条条件件下下，1 1分分钟钟内内催催化化1 1微微摩摩尔尔(umol)(umol)底底物物的的酶酶量量，或或是是转转化化1 1微微摩摩尔尔(umol)(umol)底底物物中中的的有有关关基基团团的的酶酶量。量。KatalKatal：指指在在最最适适条条件件下下，每每秒秒钟钟催催化化1mol1mol底物转化所需的酶量。简称底物转化所需的酶量。简称KatKat。2.2.酶活力的表示方法酶活力的表示方法1Kat=6101Kat=6107 7 U U注意：p以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1mol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2mol底物转化的酶量称为一个酶单位。p在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。习惯单位：在实际使用中，结果测定和应用都比较方便、直观，规定的酶活力单位，不同酶有各自的规定，如：-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。（QB546-80），也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需的酶量。DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1g纯化的DNA所需的酶量。3.3.酶的比活力酶的比活力酶的比活力：是指单位重量的蛋白质酶的比活力：是指单位重量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，即每中所含的某种酶的催化活力，即每mgmg蛋白所含的酶活力单位或每蛋白所含的酶活力单位或每kgkg蛋白中蛋白中所含的所含的KatKat数数。比活力是表示酶制剂纯比活力是表示酶制剂纯度的一个指标。度的一个指标。比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数=U(或或IU)/mg蛋白蛋白实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少）。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力总活力=比活力总体积（总重量）终点法终点法:酶反应进行到一定时间后酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。定产物或反应物量的变化。动力学法动力学法:连续测定反应过程中产连续测定反应过程中产物物 底物或辅酶的变化量，直接测定出底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。酶反应的初速度。（二）酶活力的测定（二）酶活力的测定测定初速度测定初速度最适条件最适条件S S EE要求要求斜率斜率=P/t=V（初速度初速度）Pt酶活力的测定的具体方法酶活力的测定的具体方法1）比色法）比色法 适用于酶的催化产物与特定物质反应生成有色的溶液适用于酶的催化产物与特定物质反应生成有色的溶液2）分光光度法）分光光度法 产物吸光度值与底物不同产物吸光度值与底物不同3）滴定法）滴定法4）量气法）量气法5）同位素测定法）同位素测定法6）酶偶联分析法）酶偶联分析法葡萄糖葡萄糖O2葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2H2O2+4-氨基安替吡林氨基安替吡林过氧化物酶过氧化物酶H2O+醌类化合物醌类化合物在在500nm处测定光密度处测定光密度酶活力的测定：酶活力的测定：根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液；制成一定浓度的底物溶液；根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pHpH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件；、底物浓度、激活剂浓度等反应条件；在一定条件下，将一定量的酶液和底物溶液混在一定条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间；合均匀，适时记下反应开始的时间；反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生产量或底物各种生化检测技术，测定产物的生产量或底物的减少量。的减少量。