《基因克隆》课件.ppt

现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验第一模块基因克隆技术凝胶回收或纯化目的基因凝胶回收或纯化目的基因序列测定序列测定质粒提取质粒提取连接产物的转化连接产物的转化目的基因插入载体目的基因插入载体植物体植物体植植物物总总RNA（DNA）凝胶电泳凝胶电泳A T TA RT-PCR合成目的基因合成目的基因基因克隆实验流程PCR合成目的基因合成目的基因实验内容实验内容实验一 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）及及 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验二 特异扩增片段的回收纯化、连特异扩增片段的回收纯化、连接、接、转化及质粒质粒DNA的提取提取实验一实验一聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术（PCR）Polymerase Chain Reaction琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验目的学习和掌握学习和掌握PCR扩增的原理和操作方法扩增的原理和操作方法了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响深刻理解深刻理解PCR基因扩增技术在基因扩增技术在DNA操作中的操作中的重要性重要性对含有目的基因的质粒进行对含有目的基因的质粒进行PCR验证。验证。琼脂糖凝胶分离琼脂糖凝胶分离DNA的原理的原理琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术的方法和技术多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝。PCR技 术 实 际 上 是 在 模 板 DNA(template)，引 物(primer)和种脱氧核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶(Taq)的酶促合反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（extension）PCR 简介PCR 的应用的应用PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。量要求低。因此，广泛应用于许多领域。基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量外获得突变体、提供大量DNA用于测序等；用于测序等；遗传病的产前诊断；遗传病的产前诊断；致病病原体的检测；致病病原体的检测；癌基因的检测和诊断；癌基因的检测和诊断；DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；动、植物检疫；动、植物检疫；在转基因动植物中检查植入基因的存在。在转基因动植物中检查植入基因的存在。实验原理在在高高温温（93-95）下下，DNA双双链链受受热热变变性性成成为为两两条条单单链链DNA模模板板；而而后后在在低低温温（3765）情情况况下下，两两条条人人工工合合成成的的寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与互互补补的的单单链链DNA模模板板结结合合，形形成成部部分分双双链链；在在Taq酶酶的的最最适适温温度度（72）下下，以以引引物物3端端为为合合成成的的起起点点，以以单单核核苷苷酸酸（dNTP)为为原原料料，沿沿模模板板以以53方方向向延延伸伸，合成合成DNA新链。新链。每每一一双双链链的的DNA模模板板，经经过过一一次次变变性性（解解链链）、退退火火、延延伸伸三三个个步步骤骤的的热热循循环环后后就就成成了了两两条条双双链链DNA分子。分子。如如此此反反复复进进行行，每每一一次次循循环环所所产产生生的的DNA均均能能成成为为下下一一次次循循环环的的模模板板，每每一一次次循循环环都都使使两两条条人人工工合合成成的的引引物物间间的的DNA特特异异区区拷拷贝贝数数扩扩增增一一倍倍，PCR产产物物得得以以2n的的指指数数形形式式迅迅速速扩扩增增，经经过过2530个个循循环环后后，理理论论上上可可使使基基因因扩扩增增109倍倍以以上上，实实际际上上一一般般可可达达106107倍。倍。实验仪器及试剂实验仪器及试剂PCR仪、掌型离心机、微量移液器、冰仪、掌型离心机、微量移液器、冰盒、盒、Tip头、离心管头、离心管模板模板,Primer,10XPCR buffer,dNTP Mixture,Taq 酶酶,H2O操作步骤操作步骤取PCR管，标明管号按体积配置PCR反应体系（冰上操作)轻弹管壁，混匀，掌型离心机甩至管底，立即反应反应体系ddWater 12 ul10XPCR buffer 2.0 ul+2.0 ul Mg+dNTP Mixture 2.0 ulPrimer F 0.4 ulPrimer R 0.4 ulplasmid(1-50ng)1.0 ulTaq 酶酶 0.2 ulTotal 20 ulPCR反应程序 94 3min 94 30sec 59 30sec 72 30sec 72 7min 10 30 cycles引引 物物 扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引物设计也就更为重要。PrimerIPrimerIIAmplified target fragment长度一般最低不少于长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，个核苷酸，最佳长度为最佳长度为2024个核苷酸个核苷酸。有时。有时可在可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的要，但要在酶切位点的5端加上额外的端加上额外的34个核苷个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。酸，以确保附加的酶切位点有效。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，端，即使无法避免，其即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于端互补碱基也不应大于2个碱个碱基，否则易生成基，否则易生成“引物二聚体引物二聚体”（Primer dimer）。引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（发夹结构（hairpin structures）。(G+C）%含量引物的组成应均匀含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽含量应尽量相似。量相似。引物的设计引物的设计 一般在一般在0.11M之间。浓度过高易形之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成但浓度过低，不足以完成30个循环的个循环的扩增反应，则会降低扩增反应，则会降低PCR的产率。的产率。引物在引物在PCRPCR反应中的浓度反应中的浓度引物退火引物退火一般可根据引物的（一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实含量进行推测，一般实验中退火温度验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引比扩增引物的融解温度物的融解温度Tm(melting temperature)低低3-5，可按公式进行粗略计算：可按公式进行粗略计算：Ta=Tm-3=3(G+C)+2(A+T)-3/5 其中其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典型分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如的引物浓度时（如0.2mol/L）,退火反应数秒即可退火反应数秒即可完成。完成。决定决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。性产物增加。退火时间退火时间一般为一般为2040秒，时间过短会导致复性不充秒，时间过短会导致复性不充分，后面延伸步骤时温度升高，会导致引物从模板脱分，后面延伸步骤时温度升高，会导致引物从模板脱落，落，PCR反应失败。反应失败。引物延伸引物延伸延伸温度取决于延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度，一般为聚合酶的最适温度，一般为7075。在在72时酶催化核苷酸的标准速率可达时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个个核苷酸核苷酸/秒。秒。每分钟可延伸每分钟可延伸1kb的长度的长度，其速度取决，其速度取决于缓冲溶液的组成、于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与值、盐浓度与DNA模板的性模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的时间。对于时间。对于1kb以上的以上的DNA片段，可根据片段长度将片段，可根据片段长度将延伸时间控制在延伸时间控制在17min。模板模板种类种类：单、双链：单、双链DNA或或RNA都可以作为都可以作为PCR的样品。若起始材料是的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转，须先通过逆转录得到第一条录得到第一条cDNA。用质粒作模板时，线性。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的当使用高分子量的DNA（如基因组（如基因组DNA）做）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。模板，扩增效果会更好。用量用量：虽然：虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的，但为了保证反应的特异性，还应用特异性，还应用ng级级的的DNA。模板变性温度模板变性温度决定决定PCR反应中双链反应中双链DNA解链的温度，达不解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链到变性温度就不会产生单链DNA模板，模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般双链会很快复性，因而减少产量。一般取取9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，不变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持短，以保持DNA聚合酶的活力，加入聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过聚合酶后最高变性温度不宜超过95。Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。出来的。Polymerase具有具有5-3DNA聚合活性聚合活性和和5-3外切核酸酶活性，无外切核酸酶活性，无3-5外切酶活性。外切酶活性。由于由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。延伸速度过多会导致非特异产物的增加。延伸速度1-2kb/分钟，分钟，产物产物3端带端带A，可直接用于，可直接用于T/A载载体克隆体克隆。1单位单位(U)Taq DNA Polymerase活力定义为活力定义为在在74、30分钟内，以活性化的大马哈鱼精分钟内，以活性化的大马哈鱼精子子DNA作为模板作为模板/引物，将引物，将10nmol脱氧核苷脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。寡核苷酸（dNTP）在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性PCR常用的dNTP浓度为50200M，不能低于1015M。使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。用于PCR的标准缓冲液为1050mM的Tris HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。在72时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为110mmol/L。PCRPCR缓冲液缓冲液循环参数（反应温度与时间）循环参数（反应温度与时间）变性：变性：对于富含对于富含G、C的模板应适当提高变性的模板应适当提高变性温度。温度。退火：退火：提高退火温度可减少引物与模板之间提高退火温度可减少引物与模板之间的非特异结合，提高的非特异结合，提高PCR反应的特异性；降反应的特异性；降低退火温度则可提高扩增产量。如果待扩增低退火温度则可提高扩增产量。如果待扩增目的目的DNA片段含量很少，可在片段含量很少，可在PCR前几次循前几次循环中适当延长退火时间，这样有利于引物与环中适当延长退火时间，这样有利于引物与模板的结合，提高模板的结合，提高PCR反应的灵敏度。反应的灵敏度。反应条件的调整反应条件的调整延伸延伸延伸时间由扩增片段的长度决定，扩延伸时间由扩增片段的长度决定，扩增小于增小于500bp的的DNA片段的延伸时间片段的延伸时间为为20秒，扩增秒，扩增500l200bp的的DNA片片段的延伸时间为段的延伸时间为40秒扩增片段大于秒扩增片段大于1kb，则需增加延伸时间。当扩增片段，则需增加延伸时间。当扩增片段小于小于150bp时，则可省略延伸步骤，时，则可省略延伸步骤，因为退火温度下，因为退火温度下，Taq DNA聚合酶的聚合酶的活性已足以完成短序列的合成。活性已足以完成短序列的合成。反应条件的调整反应条件的调整循环次数：循环次数：PCR的循环次数主要取决于模板的循环次数主要取决于模板DNA的浓度，的浓度，一般为一般为2535次，此时次，此时PCR产物的积累即可产物的积累即可达最大值，刚刚进入达最大值，刚刚进入“平台期平台期”。即使再增。即使再增加循环数，加循环数，PCR产物量也不会再有明显的增产物量也不会再有明显的增加。随着循环次数的增加，一方面由于产物加。随着循环次数的增加，一方面由于产物浓度过高，以致自身相结合而不与引物结合，浓度过高，以致自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效率的降低；或产物链缠结在一起，导致扩增效率的降低；另一方面，随着循环次数的增加，另一方面，随着循环次数的增加，Taq DNA聚合酶活性下降，引物及聚合酶活性下降，引物及dNTP浓度下降，易浓度下降，易发生错误掺入，非特异性产物增加。因此，发生错误掺入，非特异性产物增加。因此，在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。数。反应条件的调整反应条件的调整问题：问题：9700PCR仪的有哪些功能？PCR最关键的是什么？PCRPCR产物分析产物分析取取3 l PCR产物产物+1 l 溴芬兰，采用溴芬兰，采用0.8琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略的量粗略计算计算PCR产物的总量。产物的总量。剩余剩余17 l PCR产物，每三个同学的产物，每三个同学的PCR产产物合并为一个管中物合并为一个管中 5 l 溴芬兰，进行胶溴芬兰，进行胶回收。回收。200ml1.6g琼脂糖琼脂糖实验原理原理nDNA分子在分子在琼琼脂糖凝胶中泳脂糖凝胶中泳动动的的电电荷效荷效应应和分子和分子筛筛效效应应DNA分子在高于等分子在高于等电电点的点的pH溶液中溶液中带负电荷荷，在，在电场中向中向正正极极移移动。在一定的。在一定的电场强度下，度下，DNA分子的迁移速度取决于分子的迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型。分子本身的大小和构型。nDNA的的检测是通是通过溴乙溴乙锭的作用的作用溴乙溴乙锭（EB）是一种）是一种荧光染料，光染料，这种扁平分子可以种扁平分子可以嵌入核酸嵌入核酸双双链的配的配对碱基之碱基之间，它与，它与DNA的的结合几乎没有碱基序列的合几乎没有碱基序列的特异性。在高离子特异性。在高离子强度的度的饱和溶液中，大和溶液中，大约每每2.5个碱基插于个碱基插于一个溴乙一个溴乙锭分子。分子。当染料分子插入后，其平面基当染料分子插入后，其平面基团（菲（菲啶环）与螺旋的）与螺旋的轴线垂垂直并通直并通过范德范德华力与上下碱基相互作用，力与上下碱基相互作用，这个基个基团固定位置固定位置及其与碱基的密切接近及其与碱基的密切接近导致与致与DNA结合的染料呈合的染料呈现荧光。光。DNA吸收吸收254nm处的紫外的紫外线并并传递给染料，而被染料，而被结合的合的EB本身吸收本身吸收302nm和和366nm的光的光辐射，被吸收的能量在可射，被吸收的能量在可见光光谱红橙区的橙区的590nm处重新被激重新被激发发出出荧光，从而得到光，从而得到检测。关于关于GelRedGelRednGelRed 是一种具有凝胶染色特性，并被是一种具有凝胶染色特性，并被设计为替替换高毒性高毒性染色染色剂溴化乙溴化乙锭（EB）的）的红色色荧光核酸染色光核酸染色剂。因因为GelRed 与与EB有着相同的光有着相同的光谱特性（如特性（如图1），所以可以在），所以可以在不改不改变任何成像系任何成像系统的情况下用的情况下用GelRed 替替换EB。n如果您目前使用的是如果您目前使用的是SYBR(如如SYBR Green 1/SYBR Gold)染色染色剂，并使用紫外投射器，并使用紫外投射器(UV transilluminator）来）来观察察凝胶，那么您可以使用凝胶，那么您可以使用GelRed 替替换SYBR染色染色剂，不需要，不需要更更换现有的有的SYBR虑光片。光片。n然而，在然而，在488 nm 激光或激光或类似可似可见光下光下 GelRed 不能被充不能被充分地激分地激发，如果需要，我如果需要，我们建建议您使用我您使用我们的的GelGreen(Cat#41004)染色染色剂，其灵敏度与，其灵敏度与SYBR Green 1 一一样，但其，但其稳定性和可靠性定性和可靠性远胜于后者。于后者。nGelRed 既可用于前染既可用于前染(precast gel staining)，也可用于，也可用于后染后染(post gel staining)。通常后染比前染能。通常后染比前染能够获得更灵敏得更灵敏的特性，并能排除染色的特性，并能排除染色剂在在电泳泳过程中程中对核酸条核酸条带分离造成分离造成任何影响的可能性。然而，前染任何影响的可能性。然而，前染较后染更后染更为简单、经济，因，因为前染不需要前染不需要额外的着色外的着色过程，并且燃料用量更少。因此，程，并且燃料用量更少。因此，假如灵敏度和条假如灵敏度和条带清晰度不成清晰度不成问题，前染，前染则是首是首选。我。我们强烈建烈建议您您尝试两种染色方法，以便根据您的需要两种染色方法，以便根据您的需要选择最佳的最佳的染色方法。染色方法。实验设备及试剂n移液器，tip头，tip头盒n水平凝胶电泳槽n稳压电泳仪n微波炉n三角瓶n琼脂糖n电泳缓冲液1TAEnEB替代物 n上样缓冲液(loading buffer)电泳缓冲液缓冲液缓冲液工作液工作液贮存液贮存液/L TAE 1:40mM(Tris-乙酸乙酸)1mM EDTA50:242g Tris 57.1ml 冰醋酸冰醋酸 100ml 0.5MEDTA(pH=8.0)TPE 1:90mM(Tris-磷酸磷酸)2mM EDTA10:108g Tris 15.5ml 磷酸（磷酸（85%，1.679g/ml)40ml 0.5MEDTA(pH=8.0)TBE 0.5:45mM(Tris-硼酸硼酸)1mM EDTA 5:54g Tris 27.5g硼酸硼酸 20ml 0.5MEDTA(pH=8.0)增加增加样品的密度保品的密度保证样品沉入加品沉入加样孔内；孔内；使使样品品带有有颜色便于色便于简化上化上样过程；程；能明确能明确显现样品在品在电泳胶上泳泳胶上泳动位置。位置。溴酚溴酚蓝在在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速迁移速率的率的2.2倍，倍，这一特性与一特性与琼脂糖脂糖浓度无关。度无关。试试 剂剂含量（含量（m/v）溴溴 酚酚 蓝蓝0.25%二甲苯氰二甲苯氰0.25%甘甘 油油30%上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液(loading buffer)配方配方实验步骤n用透明胶带将胶板的两端封好。n配制0.8%的琼脂糖凝胶（0.16g琼脂糖于50ml三角瓶中，加入1TAE buffer 20ml），在微波炉中加热至琼脂糖溶解。n待溶液冷却至60左右，加入2ul溴化乙锭充分混匀。n放置合适大小的梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3-5 mm之间，大约需要凝固20min。实验步骤n凝胶完全凝固后，撕去透明胶，轻轻地拔去梳子，将胶槽移至电泳槽中，加入1TAE且使缓冲液没过胶面约1 mm。nDNA样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加入上样孔中。n盖上电泳槽，以60V电压进行电泳。n当溴酚蓝前沿在凝胶中移出适当距离后（约30min），切断电流，取出胶板，在紫外灯下检测DNA泳动情况。DNA MarkerPCR product3.0kbPCR结果作业其它PCR种类实验报告一PCRPCR结果的分析结果的分析试验结果第一组第一组第二组第二组第四组第四组第三组第三组试验结果第一组第一组第二组第二组第三组第三组第四组第四组特异扩增片段的回收纯化特异扩增片段的回收纯化 目的片段与载体的连接目的片段与载体的连接实验目的了解“DNA片段快速胶回收试剂盒”回收纯化DNA片段的原理；了解利用pGEM-T载体与PCR产物连接的原理；掌握特异扩增片段的回收纯化以及与载体连接的方法。实验原理实验原理回收纯化回收纯化DNA利用在盐试剂存在的情况下，核酸能吸利用在盐试剂存在的情况下，核酸能吸利用在盐试剂存在的情况下，核酸能吸利用在盐试剂存在的情况下，核酸能吸附在硅基质膜上的特性，用于对附在硅基质膜上的特性，用于对附在硅基质膜上的特性，用于对附在硅基质膜上的特性，用于对DNADNA片片片片段进行纯化。段进行纯化。段进行纯化。段进行纯化。目的片段与载体的连接目的片段与载体的连接利用利用利用利用PCRPCR产物带有粘性末端产物带有粘性末端产物带有粘性末端产物带有粘性末端A A，以及载体，以及载体，以及载体，以及载体上带有上带有上带有上带有T T粘性末端，在粘性末端，在粘性末端，在粘性末端，在T4T4连接酶的作用连接酶的作用连接酶的作用连接酶的作用下，在一定的温度条件下发生连接的原下，在一定的温度条件下发生连接的原下，在一定的温度条件下发生连接的原下，在一定的温度条件下发生连接的原理达到使得目的片断与载体连接的目的。理达到使得目的片断与载体连接的目的。理达到使得目的片断与载体连接的目的。理达到使得目的片断与载体连接的目的。实验仪器及试剂实验仪器及试剂仪器：恒温水浴，水平电泳槽、电泳仪器：恒温水浴，水平电泳槽、电泳仪、迷你离心机仪、迷你离心机用品：离心管、移液器、用品：离心管、移液器、500ml三角三角瓶等。瓶等。试剂：连接试剂盒、纯化试剂盒；试剂：连接试剂盒、纯化试剂盒；1TAE电泳缓冲液、电泳缓冲液、GelRed、凝胶上、凝胶上样缓冲液、琼脂糖样缓冲液、琼脂糖 凝胶电泳回收凝胶电泳回收DNADNA？连接反应、杂交反应、标记反应、扩增连接反应、杂交反应、标记反应、扩增反应等反应等去除非特异带去除非特异带脱盐，去除脱盐，去除dNTPs去除引物去除引物去除酶（碱性磷酸酶等）去除酶（碱性磷酸酶等）如果电泳是唯一的特异带，可以从如果电泳是唯一的特异带，可以从如果电泳是唯一的特异带，可以从如果电泳是唯一的特异带，可以从PCRPCR产物的产物的产物的产物的DNADNA溶液中直接纯化回收溶液中直接纯化回收溶液中直接纯化回收溶液中直接纯化回收实验步骤实验步骤PCR产物电泳产物电泳PCR产物回收纯化产物回收纯化纯化产物与载体连接纯化产物与载体连接琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收DNADNA凝胶获得及处理凝胶获得及处理凝胶获得及处理凝胶获得及处理 在在在在UVUV照射下准确切取目标条带，放入照射下准确切取目标条带，放入照射下准确切取目标条带，放入照射下准确切取目标条带，放入1.5ml 1.5ml 管中管中管中管中 加入加入加入加入3 3倍体积的倍体积的倍体积的倍体积的DDDD溶胶液，（如果凝胶重为溶胶液，（如果凝胶重为溶胶液，（如果凝胶重为溶胶液，（如果凝胶重为100mg100mg，加入，加入，加入，加入300ulDD300ulDD）放入放入放入放入5656度金属浴度金属浴度金属浴度金属浴10min10min。每。每。每。每2 23min3min振荡一次加速溶解。振荡一次加速溶解。振荡一次加速溶解。振荡一次加速溶解。将得到的溶液加入吸附柱将得到的溶液加入吸附柱将得到的溶液加入吸附柱将得到的溶液加入吸附柱ACAC中，室温放置中，室温放置中，室温放置中，室温放置1min1min，12000rpm12000rpm离心离心离心离心1min1min，倒掉收集管中的液体。，倒掉收集管中的液体。，倒掉收集管中的液体。，倒掉收集管中的液体。加入加入加入加入700ul700ul漂洗液漂洗液漂洗液漂洗液WBWB，12000rpm12000rpm离心离心离心离心30sec30sec，倒掉收集管中，倒掉收集管中，倒掉收集管中，倒掉收集管中的液体。的液体。的液体。的液体。将吸附柱将吸附柱将吸附柱将吸附柱ACAC放回空收集管中，放回空收集管中，放回空收集管中，放回空收集管中，12000rpm12000rpm离心离心离心离心2min2min，尽量除，尽量除，尽量除，尽量除去漂洗液以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。去漂洗液以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。去漂洗液以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。去漂洗液以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱取出吸附柱取出吸附柱取出吸附柱ACAC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加间部位加间部位加间部位加50ul50ul洗脱缓冲液洗脱缓冲液洗脱缓冲液洗脱缓冲液EBEB，室温放置，室温放置，室温放置，室温放置2min12000rpm2min12000rpm离心离心离心离心1min1min。得到纯化后得到纯化后得到纯化后得到纯化后DNADNA片段。片段。片段。片段。纯化产物与载体连接在在0.2ml的的PCR管中，依次加入管中，依次加入 纯化纯化PCR产物产物 7.5ul buffer 1ul pBS-T载体载体 1ul T4 DNA连接酶连接酶 0.5ul 混匀，离心，去除气泡。混匀，离心，去除气泡。16度恒温水浴度恒温水浴连接连接1216h。试验结果思考问题：连接的原理是什么呢？载体与目的片断的关系？质粒DNA的转化实验目的了解外源基因转入细胞的原理了解外源基因转入细胞的原理掌握热激转化的方法掌握热激转化的方法掌握蓝白斑筛选的基本原理掌握蓝白斑筛选的基本原理实验原理转化转化转化是指质粒是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。入细菌的过程。细菌处于容易吸收外源细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。的状态叫感受态。当细菌处于当细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的成球形。转化混合物中的DNA形成抗形成抗DNA酶的羟酶的羟基基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时短时间热击处理，促进细胞吸收间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型促使在转化过程中获得的新的表型(如如Ampr等等)得得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。素的选择性培养基上。实验原理蓝白斑筛选互补：互补：E.coli -半乳糖苷酶的两个无活半乳糖苷酶的两个无活性的片段组合而成为功能完整的酶的过程。性的片段组合而成为功能完整的酶的过程。pGEM-T载体上的载体上的poly-T位点位于可产生位点位于可产生肽段的肽段的lac-Z基因位点之内。若有外源基基因位点之内。若有外源基因插入此则破坏编码读框产生没有活性的因插入此则破坏编码读框产生没有活性的肽段。肽段。宿主菌为缺失产生宿主菌为缺失产生肽段的突变体，但能肽段的突变体，但能产生酶的其它肽段（产生酶的其它肽段（肽段）。肽段）。载体与宿主菌两者之间进行基因载体与宿主菌两者之间进行基因内互补就产生有活性的内互补就产生有活性的-半乳糖半乳糖苷酶。在苷酶。在IPTG的诱导下，载体的诱导下，载体产生的产生的肽段与宿主菌产生的肽段与宿主菌产生的肽段结合成有活性的肽段结合成有活性的-半乳糖苷半乳糖苷酶，此酶能使显色底物酶，此酶能使显色底物X-gal分分解成不溶于水的蓝色化合物，从解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。若有外源片段插而使菌落变蓝。若有外源片段插入此位点，则使载体的入此位点，则使载体的-半乳糖半乳糖苷酶基因失活，不能产生苷酶基因失活，不能产生肽，肽，也就不能形成有活性的也就不能形成有活性的-半乳糖半乳糖苷全酶，苷全酶，X-gal不能被分解，菌不能被分解，菌落为白色。落为白色。实验仪器及试剂试剂试剂含有目的基因的连接产物即含有含有目的基因的连接产物即含有DHY 基因的基因的质粒载体质粒载体TOP10感受态的大肠杆菌感受态的大肠杆菌LB培养基（液体与固体）培养基（液体与固体）抗生素（抗生素（AMP）及）及X-gal,IPTG 仪器仪器超净工作台、摇床、植物培养箱、高速冷冻离超净工作台、摇床、植物培养箱、高速冷冻离心机心机用品用品培养皿、三角瓶、培养皿、三角瓶、1.5ml离心管、移液器、冰盒离心管、移液器、冰盒所需试剂LB培养基（培养基（50 g/ml Amp）：提供细菌生长所）：提供细菌生长所需营养，并进行抗性筛选。需营养，并进行抗性筛选。用用5M NaOH 4850l调调pH值至值至7.0。Amp干扰肽聚糖交联而抑干扰肽聚糖交联而抑制细胞壁的合成制细胞壁的合成Mr=394.4（50mg/ml)：溶于水，用溶于水，用0.22m滤膜过滤膜过滤灭菌，于不透光的容器滤灭菌，于不透光的容器内贮藏于内贮藏于-20。胰化蛋白胰化蛋白胨胨（Tryptone）3g酵母提取物酵母提取物(Yeast extract)1.5gNaCl（sodium chloride）3g琼琼脂粉脂粉（Agar powder）4.5g水水至至300 mlLB培养基配方培养基配方操作步骤1.配制配制LB固体培养基，高温灭菌后冷却至固体培养基，高温灭菌后冷却至60度左右时加入相应度左右时加入相应抗生素（氨苄青霉素）混匀后倒平板。抗生素（氨苄青霉素）混匀后倒平板。2.取感受态细胞置于冰上，加入取感受态细胞置于冰上，加入3ul连接后的质粒载体，冰上混连接后的质粒载体，冰上混匀，放置匀，放置10分钟。分钟。3.42度水浴热激度水浴热激45s后迅速置于冰上后迅速置于冰上2分钟，加入预热的分钟，加入预热的LB液体液体培养基培养基800ul4.37度培养度培养30分钟，分钟，160rpm5.平板表面涂平板表面涂50ul 等体积的等体积的6.X-gal/IPTG.6.20 min后涂适量的菌液，后涂适量的菌液，7.标明板号，标明板号，37度度倒置过夜培养倒置过夜培养。7.次日长出蓝白斑后次日长出蓝白斑后4度保存。度保存。质粒质粒DNADNA的提取的提取实验目的目的了解了解碱裂解法碱裂解法制制备质粒的原理粒的原理掌握掌握质粒粒DNA小量制小量制备的方法的方法什么是什么是质粒？粒？质粒是粒是细胞染色体外能胞染色体外能够独立独立稳定定遗传的共价的共价闭合双合双链环状状DNA分子分子，约为1200kb，每一个，每一个质粒都粒都带有一段有一段DNA复制起始序列，使其能在宿主复制起始序列，使其能在宿主细菌中复菌中复制。制。质粒存在与否一般粒存在与否一般对细菌的生存没菌的生存没有决定性的影响。而有决定性的影响。而质粒本身所粒本身所带的基的基因通常有利于宿主因通常有利于宿主细胞，能胞，能够提供提供给宿宿主主细胞一些表型，如抗胞一些表型，如抗药性、分解复性、分解复杂有机物的能力等。有机物的能力等。质粒的构型粒的构型共价共价闭合合环形形DNA(cccDNA)：其两条多核苷：其两条多核苷酸酸链均保持着完整的均保持着完整的环形形结构，构，这样的的DNA通通常呈常呈现超螺旋的超螺旋的sc构型；构型；线性分子性分子(lDNA)：质粒粒DNA经过适当的核酸内适当的核酸内切限制切限制酶切割之后，切割之后，发生双生双链断裂而形成断裂而形成线性性DNA分子，通称分子，通称L构型。构型。开开环DNA(ocDNA)：两条多核苷酸：两条多核苷酸链中只有一中只有一条保持着完整的条保持着完整的环形形结构，另一条构，另一条链出出现有一有一至数个缺口，此即至数个缺口，此即OC构型；构型；实验原理原理碱裂解法是利用宿主菌碱裂解法是利用宿主菌线性染色体性染色体DNA与共价与共价闭合合环状状质粒粒DNA在拓扑学上的在拓扑学上的结构状构状态差异来分离提差异来分离提取取质粒粒DNA。在碱性在碱性(pH12.012.5)条件下，破坏碱基配条件下，破坏碱基配对，可使，可使宿主的宿主的线状染色体状染色体DNA变性充分，性充分，质粒粒DNA的的氢键虽也被破坏，但由于也被破坏，但由于处于拓扑于拓扑缠绕状状态而彼此不分而彼此不分开。开。当条件恢复正常当条件恢复正常时(加入酸性加入酸性试剂中和中和)，共价，共价闭合合环状状质粒粒DNA链会迅速准确配置，重新形成完全天会迅速准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子；而然的超螺旋分子；而线状的状的细菌染色体菌染色体DNA分子由分子由于两条互于两条互补链彼此已完全分开，会交彼此已完全分开，会交联形成不溶于形成不溶于水的水的线团结构，构，缠绕附着在附着在细胞壁碎片上，通胞壁碎片上，通过离离心去除。而心去除。而质粒粒DNA则留在上清液中，通留在上清液中，通过异丙醇异丙醇沉淀及沉淀及70%乙醇洗乙醇洗涤后即可得到后即可得到质粒粒DNA。实验试剂LB液体培养基（液体培养基（+Amp）重重组单克隆的克隆的细胞培养物胞培养物溶液溶液、溶液、溶液、溶液、溶液RNase氯仿仿/异戊醇（异戊醇（24:1）异丙醇异丙醇70%乙醇乙醇双蒸水双蒸水试剂配制配制LB液体培养基液体培养基*溶液溶液*(P1)50mM葡萄糖葡萄糖,20mM TrisHCl(pH=8.0),10mM EDTA（pH=8.0）溶液溶液(P2)0.2 mol/L的的 NaOH,1%（m/V）SDS（无需（无需灭菌，菌，现用用现配）配）溶液溶液*(P3)乙酸乙酸钾溶液溶液pH4.85.2，100 ml溶液中含溶液中含 5 mol/L 乙酸乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。氯仿仿/异戊醇异戊醇（24:1）注：注：*表示需表示需1.05kg/cm2压力下蒸汽力下蒸汽灭菌菌20min试剂作用作用溶液溶液：悬浮浮细菌，改菌，改变细胞膜的通透性。胞膜的通透性。溶液溶液：SDS的作用在于使的作用在于使细胞裂解，以胞裂解，以释放出放出质粒粒DNA和染色体和染色体DNA，在高，在高pH（12.012.5）条件下，破坏碱基配条件下，