RT-PCR步骤.pdf

RNA 提取（-80保存）1.取 50-100mg组织加入 1ml Trizol，剪碎，振荡 30s 2.转入一新 EP 管中（），室温保存 5min 3.加氯仿，振荡混合（手摇剧烈），室温放置 5min 4.12000 rpm 4离心 15min 5.转移上层水相（吸 70%）到一新 EP 管中，加异丙醇,振荡混合，室温保存 10min 6.12000rpm 4 离心 15min 7.倒掉上清，加 1ml 75%无水乙醇（4保存），振荡混合，7500rpm 4 离心5min 8.倒掉上清，室温或 37放置 20min(EP 管倒置在滤纸上)使 RNA 沉淀干燥 9.加 20ul DEPC 水至 EP 管中 10.在 50孵育 3-5min(或手握 3-5min),使 RNA 充分溶解 注意：操作过程中带手套口罩，所用到的仪器设备须经去除 RNA 酶处理（灭菌或 DEPC 水浸泡）测 RNA 浓度（以 750ul 体系为例）11.调零：750ul DEPC 水 12.测量：745ul DEPC 水+5ul RNA 13.总 RNA 浓度=OD26040稀释倍数（150 倍）ug/ml 14.=OD26040150 ug/ml 15.=OD2606 ug/ul 16.A260/A280 应在之间 逆转录（cDNA：一周内-20保存，长期-80保存）方法一：以通用试剂盒为例，反应体系 20ul 1.RNA 短暂离心 2.RNA 模板,再加入 Oligo(dt)1ul,加 DEPC 水补齐至 10ul.轻轻混合均匀，短时间离心 3.将反应液置于 65 5min 冰上 1min,短时间离心 4.按顺序加入：5buffer 4ul 200ul 核糖核苷酸酶抑制剂 10mm dNTP MIX 1ul 逆转录酶 1ul RNase-free H2O 轻轻混合均匀，短时间离心 5.将混合物置于 37，60min 6.75加热 15min,中止上述反应，置于冰上 注意事项 1.RNA 提取和逆转录时所用器具均应在 1DECP 水中避光浸泡过夜，再高压烘干 2.DECP 水配制（先加 DEPC，再加水，避光过夜，然后高压）3.75%无水乙醇配制（DEPC 水：无水乙醇=1:3）4.RNA 提取和逆转录时应全程佩戴一次性手套和口罩 聚合酶链反应 PCR(产物-20保存)方法一：125ul 的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心 Template 1ul/3ul Primer 1 1ul Primer 2 1ul 10*Taq Buffer 5ul dNTPs(10mM)1ul Taq 酶 1ul ddH2O 补至 25ul 循环:94 5min 94 45s Tm+4 45s 72 45s 2 29-34(从第 2 步开始循环 30-35个循环)72 10min 4 12h PCR 结束后-20保存或置于冰上开始电泳。退火温度计算 2（A T）4（G C）正反义平均数，再上下波动度（4，或5）引物稀释方法 1.引物先离心，后用 DEPC 水或双蒸水稀释成 10 倍母液 2.再取 5ul 母液，加 45ulDEPC 水或双蒸水稀释 10 倍成操作液