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灵芝多糖抗肿瘤的细胞机制及作用通路研究 灵芝多糖鸭功效与作用 摘要：灵芝多糖是灵芝的主要活性物质，对荷瘤机体有免疫调整作用，包括提高抗原提呈细胞、单核吞噬细胞功能，增加细胞和体液免疫功能，在体内引起一系列信号级联反应。但灵芝多糖的免疫调整及抗肿瘤作用机制尚未非常明确，仍有很多问题尚待解决。 关键词：灵芝多糖；抗肿瘤药；免疫调整；信号通路 中国分类号：Q257文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)07-0048-04 Study on Cellular Mechanisms and Signaling Pathway of Antitumor Activity of Ganoderma lucidum polysaccharides LIU Yuan, GENG Yue* (College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China) Abstract：Ganoderma lucidum polysaccharides are the main efficacious ingredients of Ganoderma lucidum, which can modulate immune function in tumor-bearing animals, including improving the functions of antigen presenting cells and mononuclear phygocyte system, promoting cellular immunity and humoral immunity, triggering a series of signaling cascades. However, the mechanism of action is not clear on immunological regulation and antitumor and many questions and development prospects are needed to be solved. Key words：Ganoderma lucidum polysaccharides; antitumor agent; immunoregulation; signaling pathway 近年，对真菌及其代谢物中抗肿瘤有效成分的探讨日益得到重视，应用灵芝多糖（GLP）治疗肿瘤已成为手术、放化疗的协助方法。目前已分别到的灵芝多糖有200多种，大部分为型葡聚糖。试验证明，灵芝提取物或灵芝菌丝体多糖对体外培育的肿瘤细胞无干脆抑制作用，也不能诱导肿瘤细胞凋亡，但对体内肿瘤有明显的抑制作用1。由此认为，灵芝多糖可能通过调整免疫功能间接地抑制了肿瘤细胞的生长和增生，甚至杀伤肿瘤细胞。目前普遍的观点是，灵芝多糖能干脆或间接激活自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞，促进未经纯化的脾细胞在体外增生，增加DNA多聚酶的活性及促进白细胞介素（IL）分泌等，实现其免疫功能。现从灵芝多糖抗肿瘤的免疫机制及可能的信号通路方面作一简要综述。 1灵芝多糖抗肿瘤的免疫调整作用及机制 灵芝多糖的免疫调整作用是广泛的，不仅包括提高抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）、单核细胞吞噬系统的活性，而且包括增加细胞免疫和体液免疫功能，作用位点涉及从免疫前体细胞增生、分化到效应细胞的各个过程。 1.1对NK细胞活性的影响 NK细胞来源于骨髓，分布于淋巴结、脾脏和外周血，在机体防卫及肿瘤监视中起重要作用。NK细胞对敏感靶细胞的杀伤效应不受靶细胞是否表达主要组织相容性复合物（MHC）的影响，不须要抗原事先刺激和抗体存在就能发挥细胞毒性（NK活性），可被多种可溶性增加因子激活。 灵芝多糖的抗肿瘤作用与NK细胞激活亲密相关。韩纪举等2将不同浓度的GLP（3.0，0.3，0.03，0.003，0.000 3 mg/mL）加入培育的NK细胞中，均能提高NK细胞活性，其中以0.3 mg/mL组NK细胞活性最强，与其它各组相比差异极为显著（P0.01）。NK细胞活化后即可释放抗肿瘤坏死因子（TNF-）、IL-2、干扰素（IFN-）等细胞因子，并呈正向调整作用，进一步调整巨噬细胞的功能，扩大抗肿瘤作用。此外，NK细胞还是获得性细胞免疫的核心调整细胞，肿瘤浸润的NK细胞（TNK）对产生肿瘤特异细胞毒性T淋巴细胞（CTL）很重要3。 1.2对单核细胞吞噬系统的影响及作用通路 灵芝子实体水提物或灵芝多糖能提高体内外巨噬细胞的吞噬作用4。李明春 等5证明，用灵芝多糖处理小鼠腹膜巨噬细胞后，IL-1及TNF-产生明显增多。Berovic等6报道，从灵芝中分别出一种主要由-D-葡聚糖组成的多糖，它能诱导原代培育的人外周血单核细胞（PBMC）TNF-合成。从灵芝孢子中分别的一种多糖还能刺激巨噬细胞分泌IL-1和NO7。此外，灵芝多糖能提高人噬中性粒细胞的吞噬活性和迁移活性，并依靠Akt信号通路抑制体外自发的和自杀相关因子（Fas）诱导的噬中性粒细胞凋亡8。 Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）是一种跨膜蛋白，通过识别病原相关模式分子，激活先天免疫系统产生前炎症因子和抗微生物肽，抵挡病原所致的损害，同时作为预警信号，向APC发出警报，启动后天免疫系统。TLR4是巨噬细胞的主要受体，能与多糖干脆结合，介导免疫反应的下游事务，产生细胞因子9。采纳细胞培育和竞争性蛋白结合分析法发觉，小鼠腹腔巨噬细胞经灵芝多糖处理后cAMP浓度上升10；将人噬中性粒细胞暴露在灵芝多糖中也能时间依靠性的增加蛋白激酶C（PKC）、p38有丝分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、造血细胞激酶（HCK）及其他酪氨酸激酶活性11。因此推想，灵芝多糖可能通过两条通路活化单核细胞，提高非特异性免疫反应：一条是通过激活兴奋性G蛋白，在ATP作用下活化腺苷酸环化酶，引起cAMP浓度上升，活化蛋白激酶A（PKA），使其底物发生特异性磷酸化，激活巨噬细胞；另一条是通过激活PKA/p38、MAPK/ERK（ERK指胞外信号调整激酶）通路，见图1。 1.3对树突细胞（DC）的影响及作用通路 DC是专职的APC，对启动初次免疫反应起关键作用。将未成熟的DC与灵芝多糖共培育，发觉细胞表面有CD11c及I-A/I-E（MHC I类基因上的一段区域称为I-A、I-E 区，其编码蛋白称为I-A/ I-E）分子共表达，表明灵芝多糖能促进DC成熟，其促DC成熟的机制与促I-A/I-E表达有关。灵芝多糖（10g/mL）处理DC后，明显增加细胞表面CD80、CD86、CD83、CD40、CD54及人白细胞抗原（HLA-DR）的表达，同时促进胞内IL-12 p70和p40，IL-10，IL-12 p35和p40，IL-10 mRNA的表达12，13。活化后的DC可诱导CTL表达IFN- mRNA、颗粒酶B mRNA，培育的上清液中IFN-和颗粒酶B蛋白含量增加，表明在DC成熟阶段，灵芝多糖能增加DC对肿瘤抗原的捕获、处理、提呈实力，增加DC诱导的特异性CTL细胞毒性。IFN-增加又可通过干脆或间接作用进一步发挥抑瘤作用14。 用特异性抗TLR4抗体处理DC后，灵芝多糖诱导DC生成IL-12 p40和IL-10的功能受到抑制，表明TLR4在DC信号通路中同样占重要地位。进一步探讨表明，灵芝多糖能增加核因子-B抑制物（IB）激酶和核因子-B（NF-B）的活性，促进IB和MAPK磷酸化；若用特异性抑制剂抑制NF-B、p38 MAPK后，DC表面成熟标记物消逝，表明灵芝多糖主要是通过NF-B、p38 MAPK通路快速而有效地调整DC的成熟和活性12。 1.4对T细胞的影响及作用通路 灵芝多糖可增加荷瘤小鼠血液中白细胞、淋巴细胞的总数，但并不与剂量呈线性关系，存在最适剂量。灵芝多糖还可引起体外培育的小鼠脾细胞DNA多聚酶活性增加，DNA、RNA含量增加，细胞内超微结构变更，细胞质和细胞核的平均截面积增加，核质比下降，表明灵芝多糖在促进脾细胞蛋白质合成的同时促进细胞增生15。Wang等16用RT-PCR法发觉灵芝多糖处理能促进小鼠脾细胞分泌IL-1、IL-2、IFN-，但对IL-4、IL-6影响不大。 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）动态监测灵芝多糖均一组分GLB7对小鼠T细胞胞浆游离Ca2+浓度和胞内pH的影响，结果显示，GLB7 20 mg/L即引起小鼠T细胞中Ca2+浓度和pH明显上升17。经进一步试验还发觉，GLB7能促进1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）、二酰基甘油（DAG）产生，剂量依靠性的活化PKA、PKC，表明GLB7可能通过IP3/Ca2+，DAG/PKC通路激活T细胞18。 1.5对B细胞的影响 给小鼠灌胃不同剂量灵芝多糖（2.15，0.65，0.22 mg/kg）2周后，抗体生成细胞的吸光度值（A）及高剂量组小鼠的血清血溶素（抗体积数）和比照组的差异均有显著性 (P0.01，P0.05)19，表明灵芝多糖对小鼠的体液免疫功能具有肯定的调整作用，且与剂量亲密相关。 灵芝多糖在体外能显著提高脂多糖（LPS）诱导的淋巴细胞增生20。从灵芝的子实体分别得到的一种灵芝多糖GLIS能刺激B细胞活化、增生和分化。增生后的B细胞表面表达CD71、CD25，分泌免疫球蛋白也增多，而且B细胞活化不依靠T细胞活化，这与B细胞表达PKC、PKC有关。然而，它不影响B细胞内Ca2+浓度21。由此可见，灵芝多糖对B细胞的作用通路与对T细胞不同，但详细机制尚待进一步探讨。 2影响灵芝多糖活性的构效关系 功能性多糖的生物活性不仅与其相对分子质量（Mr）、溶解度、分支度有关，而且与其分子的初级结构和高级结构有关。目前分别到的灵芝多糖大部分为葡聚糖，Mr从数十万到数百万，大多不溶于高浓度乙醇而溶于热水，有3股单链构成，螺旋层之间主要用氢键固定。其分子结构干脆影响灵芝多糖的抗肿瘤效果，甚至确定它有无抗肿瘤活性。具有抗肿瘤活性的灵芝多糖大多为-(1,3)葡聚糖，且分支度高的活性较高；Mr高的活性也较Mr低的活性大；一旦变更灵芝多糖的螺旋结构其抗肿瘤活性不复存在22。 3目前有待解决的问题与前景展望 灵芝多糖对免疫系统的调整作用在动物及人体内外已得到证明。但灵芝多糖分子中能产生上述生理功能的主要是含有-(1,3)键的葡聚糖，而人体无法在胃肠道内酶解-(1,3)键的多糖。因此，人体是怎样利用灵芝多糖进行免疫调整还是一个谜。虽然人体中存在一种活跃的黏膜淋巴细胞（IELs），遇到抗原（如多糖）时能刺激其他淋巴细胞产生、活化，但它是否在灵芝多糖中发生作用，也是一个谜。此外，灵芝多糖Mr高，它是如何进入细胞发挥功用的也待探讨。 随着对灵芝多糖的深化探讨，灵芝多糖抗肿瘤的作用机制将更加清楚明确。其特别的养分、保健、药用功效将受到更广泛的关注，以灵芝多糖为功能因子的保健品将具有更广袤的开发前景和崭新的应用价值。 参考文献 1张群豪，於东晖，林志彬. 用血清药理学方法探讨灵芝浸膏GLE的抗肿瘤作用机制J. 北京医科高校学报，2000，32（03）：210-213. 2韩纪举，邓文，亓新国，等. 灵芝多糖对NK细胞活性影响的探讨J. 泰山医学院学报，2002，23（02）：155-156. 3宁安红，曹婧，黄敏，等. 灵芝多糖对荷瘤小鼠肿瘤免疫系统的影响J. 中国微生态学杂志，2004，16（01）：13-14. 4Jiang Z Y, Lin C. 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