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生血增白汤对骨髓移植小鼠造血微环境的影响_骨髓移植对捐献者危害 （1.青岛市海慈医疗集团，山东 青岛 266033；2.山东中医药高校，山东 济南 250355） 摘 要：目的：探讨生血增白汤对骨髓移植小鼠造血微环境的影响。方法：将试验动物随机分为5组：正常组，未做任何处理；比照组、G-CSF组、生血组、生血+G-CSF组，建立小鼠骨髓移植模型，生血组及生血+G-CSF组胃饲生血增白汤浓缩煎剂。骨髓移植后的第9、14、24天进行外周血细胞和骨髓单核细胞计数，并做骨髓组织学视察。结果：骨髓移植后第9、14、24天生血组外周血细胞、血红蛋白、骨髓有核细胞计数及骨髓细胞增生程度均高于其他各比照组（P0.05或P0.01）。结论：生血增白汤具有肯定的上升外周血白细胞、红细胞、血红蛋白的作用，并且能够促进骨髓移植小鼠骨髓组织增殖分化，骨髓细胞造血组织容量和成熟红细胞容量增加，脂肪组织容量削减，骨髓造血微环境得到有效改善。 关键词：血虚；骨髓移植；造血微环境；补肾健脾；造血重建 中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717（2011）03-0537-04 The Influence on Making-Blood Microenvironment about Marrows Transplanting Mice by Shengxuezengbai Decoction ZHANG Dong1，SUN Jin-fang1，SUN Jing2 （1.Qingdao,Haici Hosp，Qingdao 266033,China;2.Shandong University of TCM, Jinan 250355,Shandong,China） Abstract:Objective: To explore the Influence on Making-Blood Microenvironment about Marrows Transplanting Mice by Shengxuezengbai Decoction. Methods: The experimental animals were randomly divided into 5 groups: The normal group received no treat. BMT control group, G-CSF group, Shengxue group, Shengxue+ G-CSF group. BMT mouse models were established. Shengxue group, Shengxue+ G-CSF group were given Shengxuezengbai Decoction. On days 9,14, 24 after BMT, mice were killed and peripheral blood cells, bone marrow nucleated cells were detected. Histological observation of bone was made. Results: In Shengxuezengbai Decoction group, the peripheral blood cell, bone marrow nucleated cell on the days 9,14,24 after BMT were higher than the other control groups（P0.05或P0.01）.Conclusion: Shengxuezengbai Decoction can increase the number of WBC、RBC、HGB of outer blood cycle, and can promote the marrow tissues multiplication and differentiation of BMT mice, the capacity increase of the marrow cell making-blood tissues and the mature red blood cells, the capacity decrease of the adipose tissues, so that the marrow making-blood microenvironment develops effectively. Key words:blood deficiency；bone marrow transplant；hemopoietic microenvironment；tonifying Kedney and spleen；hemopoiesis-reconstruction 收稿日期：2010-11-17 基金项目：山东省中医药管理局资助项目（2005-025） 作者简介：张栋（1974-）男，山东青岛人，主治医师，医学硕士，探讨方向：中西医结合肿瘤的防治。 通讯作者：孙静（1975-），女，山东青岛人，副教授，博士探讨生，探讨方向：中西医结合防治肿瘤的探讨。 骨髓移植（BMT）作为治疗某些血液病、恶性实体瘤等的重要方法，已得到广泛应用。但在临床上亦有很多患者因为造血干/祖细胞植入率低下和造血重建不良而导致移植失败。骨髓造血重建过程是一个多阶段、多因素的过程。其中造血微环境的修复、归巢造血干/祖细胞的自我更新、增殖和分化实力干脆影响着造血功能的重建1。骨髓移植后状态中医辨证属“血虚”，中医有丰富的关于血虚的理论和临床实践阅历，本探讨选用临床疗效准确的“生血增白汤”为治疗方剂，视察其对外周血的影响，促进骨髓增殖分化，改善骨髓造血微环境，为临床补肾健脾法促进造血干细胞移植后骨髓重建立血供应肯定的科学依据。 1 材料与方法 1.1 动物 近交系Balb/c小鼠（SPF级）150只，雄性，8、9周龄，1720g，购自北京维通北京维通利华试验动物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2002-0003）。 1.2 药品及试剂 试验所用药材（当归20g，何首乌20g，枸杞子20g，菟丝子20g，女贞子20g，淫羊藿20g，人参10g，赤芍10g，白术15g，肉桂6g）一次同批购自济南建联中药店，并经山东中医药高校中药学院周长征副教授鉴定。rhG-CSF（重组人粒细胞-集落刺激因子）：齐鲁制药有限公司生产，批号：20060511；硫酸庆大霉素注射液：山东鲁抗辰欣药业有限公司生产，批号：060619302；红霉素：大连美罗大药厂生产，批号：20060704。 1.3 仪器 Sysmex F-820自动血球计数仪，日本希森美康公司；HPIAS-1000高清楚度彩色病理图像测量系统（华中科技高校同济医学院千屏影像工程公司）。 1.4 药物制备 常规方法制备中药水煎液，配制成100 %药液（即浓度调至每毫升药液含生药1g），冷却装入灭菌药瓶，置4冰箱备用。 1.5 动物模型制备 参照文献方法2，从照耀前l周起先常规喂饮小鼠庆大霉素（32×104U/L）。除正常组外，其余各组经60Co射线一次性全身匀称照耀（钻源由山东省农科院能源所供应），照耀剂量8.0Gy，剂量率为0.5Gy/min，照耀时间约16min，照耀距离为4m，4h后行骨髓移植。取健康BALB/C小鼠，颈椎脱臼处死后，75%的乙醇浸泡10min，在超净台内用无菌剪马上取双侧股骨，用PBS冲出骨髓腔内的骨髓，制备有核细胞悬液，调浓度至2×107/mL，4h内经尾静脉，注入受照耀的BMT+G-CSF组、BMT+生血增白汤处理组、BMT+生血增白汤组+G-CSF组小鼠体内（供体鼠和受体鼠比例为14），每只受鼠经尾静脉注入单个核细胞悬液0.2mL（注入细胞数为2×106/只）。 1.6 分组与给药 将试验动物随机分为5组，每组30只。正常组，未做任何处理；BMT比照组（下简称模型组）、BMT+粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）组、BMT+生血增白汤处理组（下简称生血组）、BMT+生血增白汤组+G-CSF组（下简称生血+G-CSF组）。正常组、2次/d每日两次；BMT+G-CSF组赐予胃饲生理盐水0.25mL/只，同时皮下注射G-CSF 0.125mL/只（含G-CSF 0.1g/0.125mL）；BMT+生血增白汤组赐予胃饲生血增白汤浓缩煎剂0.25mL/只（剂量相当于成人临床有效剂量的9倍）。同时皮下注射生理盐水0.125mL/只，2次/天；BMT+生血增白汤组+G-CSF组赐予胃饲生血增白汤浓缩煎剂0.25mL/只，同时皮下注射G-CSF0.125mL/只（含G-CSF 0.1g/0.125mL）,2次/天，以上四组均用药至处死为止。 1.7 检测指标 1.7.1 外周血液成分 分别于连续用药后第14、24天末次给药24h后，随机取各组小鼠8只，断尾静脉取血，用玻璃毛细吸管取血20l，用血球计数仪自动检测红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）。 1.7.2 骨髓单核细胞 （BMNC）计数 于连续用药后第9、14、24天末次给药24h后，颈椎脱臼法处死，随机取各组小鼠6只。分别取右侧股骨，用PBS缓冲液从骨髓腔冲出单个核细胞，用光学显微镜在血球计数板上记数4个大方格，计算出每根股骨中骨髓单核细胞数。 1.7.3 骨髓组织学视察 连续用药后第9、14、24天末次给药24h后，取上述中所用小鼠左侧股骨，10%中性甲醛固定，常规HE染色，光镜下视察以下指标：估算造血组织的增生度、脂肪组织增生状况和微血管、血窦扩张裂开出血的程度，随机记取15个视野中造血组织、脂肪组织、及血窦中红细胞各自的点计数，并计算各自所占的容量比。 1.8 统计学方法 计量资料用均数±标准差（±s）表示，用t检验进行比较，用SPSS 14.0软件进行统计分析，以P0.05作为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 对外周血液成分WBC、RBC及HGB的影响 如表1所示，经8.0Gy60Co照耀各组小鼠外周血中的WBC数均明显下降，BMT后14天，G-CSF组和生血组均有不同程度的回升。BMT后24天，各给药组较模型组回升明显，其中生血组较模型组有显著性差异（P0.05）。照耀后各组小鼠外周血中的RBC数均有下降，但程度不明显（P0.05），其中各用药组间未见明显差别，至第24天各组小鼠红细胞数已复原到接近正常水平（P0.05或P>0.05）。BMT后14天，各组小鼠外周血中的HGB仍明显低于正常组（P0.01），但生血组明显高于G-CSF组和模型组（P0.05）。至第24天，各组HGB均复原到接近或达到正常水平。 表1 对骨髓移植小鼠外周血WBC、 RBC及HGB的影响（n8） 注：与正常组比较,*P0.05 ；与正常组比较,*P0.01；与模型组比较,P0.05；与模型组比较,P0.01；与生血增白汤比较,P0.05；与生血增白汤比较,P0.01。 2.2 对骨髓BMNC计数的影响 如表2所示，BMT后第9、14、24天各组小鼠BMNC均显著低于正常组（P0.01），但可见渐渐回升，生血组、G-CSF+生血组、G-CSF组明显高于模型组（P0.01）。 表2 对骨髓移植小鼠骨髓BMNC的 影响（×106/根股骨，n10） 注：与正常组比较,*P0.05 ；与正常组比较,*P0.01；与模型组比较，P0.05；与模型组比较，P0.01；与生血增白汤比较,P0.05；与生血增白汤比较,P0.01。 2.3 骨髓组织形态学检查 如表3所示，BMT后各组小鼠造血组织容量均低于正常组。各时间段各用药组造血组织容量均高于模型组，其中在第14天各用药组与模型组间存在明显差异（P0.01或 P0.05）。BMT后各时间点药物组脂肪组织容量均低于模型组，其中G-CSF组G-CSF+生血组在各时间点与模型组相比都有显著差异（P0.01），并且上两药组在各点的脂肪组织含量亦均低于生血组。各药物组成熟红细胞容量在BMT后各时间点均低于模型组，其中第14、24天与模型组相比有显著性差异（P0.01）。G-CSF在各时间点明显低于生血组，二者相比有显著性差异（P0.01），G-CSF+生血组成熟红细胞容量亦均低于生血组，在第14、24天二者有明显差异（P0.01或P0.05）。从总体趋势看，各药物组成熟红细胞渐渐复原到接近正常水平，但模型组复原较慢。 如图13所示，镜下视察可见，照耀后9天，小鼠骨髓造血组织明显削减，脂肪组织较多，血窦扩张，有大量红细胞溢出。照耀后第24天，模型组骨髓组织仍损伤严峻，未见有明显修复，血窦扩张、大量红细胞溢出，未见有巨核细胞，并有梭形成纤维细胞增生。各给药组在连续用药后，骨髓造血组织则有不同程度的修复，可见脂肪组织较少，血窦扩张不明显，骨髓有核细胞、巨核细胞明显增加，但亦见有少量成纤维细胞。 表3 对骨髓移植小鼠骨髓造血组织、 脂肪组织、成熟红细胞容量的影响（%，n6） 注：与正常组比较,*P0.05 ；与正常组比较,*P0.01；与模型组比较,P0.05；与模型组比较,P0.01；与生血增白汤比较,P0.05；与生血增白汤比较,P0.01。 3 讨 论 祖国医学认为，血是机体生命活动的物质基础，生成于水谷精微与肾中精气，主于心，藏于肝，统摄于脾，运行于经脉之中而发挥濡养功能。脾胃为后天之本，气血生化之源，肝藏血，肾藏精，乙癸同源，精能生血，精血互化。“生血增白汤”依据中医补肾健脾为组方原则，在临床治疗贫血、慢性再障、白细胞削减诸病中取得了良好的疗效，疗效确定。大剂量放疗后的骨髓移植患者所表现的造血功能障碍属于中医血虚证的范畴，骨髓移植后的在植入失败高风险的造血干细胞移植的同时，结合中医药治疗，以协助植入及促进造血干细胞增殖、分化，可以削减移植失败，促进造血功能的复原。 全血细胞削减是机体骨髓等造血器官全面受损的结果，造血器官属于辐射敏感组织，在射线作用下可快速发生结构功能与功能的严峻病变，导致各系各发育阶段血细胞的数量、质量、形态等多方面的缺陷。本试验结果显示，辐照后各组小鼠白细胞均有明显下降，与白细胞寿命短暂、对放射敏感符合。各药物组对骨髓移植后小鼠下降的白细胞均有促回升作用，尤以生血增白汤明显，提示生血增白汤有肯定的提升外周血白细胞的作用。外周血细胞对放射有相像的敏感性，但因红细胞的寿命较长，平均为120天，因此照后红细胞下降不及白细胞明显。由本试验结果看，生血组红细胞高于模型组，生血增白汤有肯定的提升外周血红细胞的作用。各组小鼠HGB在照耀后均有明显下降，各给药组在第14天HGB数均高于模型组。提示生血增白汤有上升外周血红蛋白的作用。 骨髓是主要的造血组织，骨髓单核细胞数量的改变可反映骨髓造血功能的受损和复原状况。本探讨表明，放射后血虚小鼠的骨髓单核细胞较正常组明显削减。连续给血虚小鼠灌服生血增白汤14天后，骨髓单核细胞明显增加。G-CSF亦有增加单核细胞作用。两者合用有增效作用。提示生血增白汤提高外周血细胞的作用，与减轻骨髓损伤，促进血虚小鼠骨髓单核细胞增殖，提高骨髓造血细胞总量，促使造血功能尽早复原的作用有关。由对小鼠骨髓造血组织、脂肪组织、红细胞容量定量视察表明，模型组小鼠在放射后造血组织容量明显低下，脂肪组织、成熟红细胞比例较高，至第24天仍未见明显修复。各用药组在各时间点造血组织容量均高于模型组，而脂肪组织、红细胞容量均低于模型组，二者存在明显差异。镜下视察骨髓组织形态学变更可见，模型组骨髓组织损伤严峻，表明小鼠受60Co射线全身照耀受损后，骨髓组织病理学变更修复不明显，并有纤维化趋势。各给药组在连续用药后，骨髓造血组织则有不同程度的修复，表明生血增白汤对放射损伤的骨髓组织有明显效果，能够有效促进骨髓造血组织复原。 综上试验结果，生血增白汤能够增加外周血白细胞、红细胞、血红蛋白的数量，促进骨髓增殖分化，有明显的促进骨髓抑制血虚小鼠造血重建的作用，初步证明了补肾健脾中药在造血干细胞移植领域应用的可能意义，为中医药在这一领域的应用供应了部分理论依据，而其更深层次的机理及意义还有待进一步探讨。 参考文献 1 Devine SM，Hoffman R.Role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantationJ.Curr Opin Hematol，2000，7（6）：358. 2 高汉林，谢蜀生，杨四旬，等.胸腺基质细胞促进骨髓移植小鼠免疫功能重建J.中华血液学杂志，l995，16（2）：8l-83.