三叶青提取物对人恶性黑色素瘤细胞A375体外抑制作用.pdf

百度文库-好好学习，天天向上-1 浙江大学远程教育学院 本 科 生 毕 业 论 文（设 计）题 目 三叶青提取物对人恶性黑色素瘤细胞A375的体外抑制作用 专 业 药剂学 学习中心 海宁医学中心 姓 名 学 号 指导教师 张水利 2011 年 10 月 20 日 百度文库-好好学习，天天向上-2 论 文 摘 要 随着人们生活水平的提高，人们对健康的重要性看的越来越重，但是同时随着工业化进程的加快，环境污染越来越严重，一些不治之症开始在我们身边不断出现，新增癌症患者逐年上升，抗癌，也成为人类和癌魔旷日持久的战争。癌症的治疗效果往往不够理想。目前治疗癌症常用的方法有：外科手术、放疗化疗和中医药治疗，但是外科手术、放疗化疗往往治标不治本，手术切除肿块，短期疗效可见，早期肿瘤切除后，可以获得临床治愈。但是手术无法切除肉眼不可见的微小病灶和转移扩散的癌症细胞，研究已经证明：手术会刺激癌症生长，加速癌症转移；放疗、化疗具有全身作用，对多种癌症有都一定的疗效，有够明显的缩小癌症，防治转移和复发，但副作用较大，尤其是对骨髓的抑制，使白细胞下降，具有一定的风险。中医中药治疗癌症对于减轻癌症病人的症状和痛苦，提高生存质量，延长生命，降低癌症死亡率，都有其重要的意义：副作用小、经济上比较便宜、弥补手术放化疗的不足等优点。关键词：三叶青，人恶性黑色素瘤 A375 细胞，体外抑制 目 录 引 言 三叶青提取物是否真的对肿瘤细胞起作用，本文将通过具体实验来论证，为今后抗肿瘤活性成分的研究提供科学依据。方法：采用 MTT 比色法，测定三叶青提取物对 A375 细胞活性抑制作用的时效、量效关系；光学显微镜法观察其对细胞形态的影响。结果：三叶青提取物以 125 mg/L 的浓度与 A375 细胞共同培养，在 48h 对细胞活性的抑制最为显著；不同浓度的三叶青提取物和 A375 细胞共同培养，乙酸乙脂、三氯甲烷部位对 A375 细胞活性有显著性影响，且呈浓度依赖性。光学显微镜下可见典型凋亡细胞形态学改变。结论：三叶青提取物对 A375 细胞具有明显的体外抑制作用。百度文库-好好学习，天天向上-3 一、材料与方法（一）材料 1、三叶青原料 三叶青饮片产自云南，购自宁波鄞州医药药材公司，经浙江医药高等专科学校实验师鉴定为Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg。2、细胞株 人恶性黑色素瘤细胞株 A375 购自上海中科院细胞生化所。3、试剂与仪器 MTT 3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide：美国 Amresco 公司；RPMI 1640 培养液：美国 Invitrogen 公司，批号：；胎牛血清：上海蓝季科技发展有限公司，批号：；胰岛素：上海蓝季科技发展有限公司，批号：；5-氟尿嘧啶注射液：天津金耀氨基酸有限公司，批号：。酶标仪：美国 Bio-Rad 公司；倒置生物显微镜：Motic 实业集团有限公司；CO2培养箱：力康生物医疗科技控股有限公司。（二）方法 1、三叶青提取物制备 三叶青饮片，95%乙醇回流提取 3 次，每次 1 小时，60%乙醇乙醇回流提取3 次，每次 1 小时，合并提取液，过滤，减压浓缩得乙醇浸膏，用少量水将乙醇浸膏分散，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂后，得到石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。2、三叶青提取物溶液制备 取三叶青乙醇提取物适量，用1 mL DMSO溶解，用含 10%（体积分数）灭活新生小牛血清 RPMI-1640 培养液稀释，分别配制成 20、100、500、2500 mg/L 溶液，备用。石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位同法操作，分别配制成20、100、500、2500 mg/L 溶液，备用。3、阳性对照溶液制备 精密量取 5-氟尿嘧啶注射液适量，加入 1 mL DMSO，用含 10%灭活新生小牛血清 RPMI-1640 培养液稀释，分别配制成 20、100、500、2500 mg/L 溶液，备用。4、细胞培养 A375 细胞用含 10%（体积分数）灭活新生小牛血清 RPMI-1640 培养液在37、5%CO2、饱湿条件下培养。5、提取物的时效关系 取对数生长期 A375 细胞用%的胰蛋白酶进行消化后，以 5000 个/孔的密度接种于 96 孔培养板，培养 24 小时后，分别加入 500 mg/L 的三叶青乙醇提取物溶液、各提取部位溶液 50 L，终浓度为 125 mg/L。空白对照组加50L 培养液，百度文库-好好学习，天天向上-4 阳性对照组加入 500 mg/L 的 5-氟尿嘧啶溶液 50 L，分别在 24、48、72h、96h测定细胞活性。6、提取物的量效关系 取对数生长期A375 细胞用%的胰蛋白酶进行消化后，配成个 L-1的细胞悬液接种于 96 孔培养板，每孔加细胞悬液150 L；培养 24 小时后，分别加入 20、100、500、2500 mg/L 的三叶青乙醇提取物溶液、各提取部位溶液 50L，终浓度为 4、25、125、625 mg/L。空白对照组加 50 L 培养液，阳性对照组分别加入 20、100、500、2500 mg/L 5-氟尿嘧啶溶液 50 L，分别在 48h 测定细胞活性。1.2.7 细胞活性测定 每孔加入 5g/L MTT 20 L，培养 4h 后，弃去上清液，加入 150 LDMSO 震荡 10min，570 nm 波长下测定 OD 值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-实验组平均 OD 值/对照组平均 OD 值）100%7、细胞形态学观察 倒置光学显微镜观察不同浓度的三叶青乙酸乙酯提取物及三氯甲烷提取物作用 A375 细胞 48h 后，与阴性对照组、阳性对照组比较，各药物浓度对A375细胞的影响。8、统计方法 每剂量组设3 复孔，重复 3 次，本实验数据采用进行处理，结果均用sx 表示，用 ANOVA 单因素方差分析法对结果进行统计分析，当 P时，认为两组间有显著性差异。二 结果（一）提取物的时效关系 A375 细胞贴壁培养 24h 后，用 MTT 法检测发现，正常组细胞活性逐步提高，48h 后活性达到最高，以后因细胞过度增殖而导致活性急剧下降；加入三叶青各提取部位溶液后，细胞增殖受到抑制，尤其是乙酸乙酯提取物与三氯甲烷提取物，在 48h 对细胞活性的抑制最为显著（P）。因此在量效关系研究采用48h 作为时间观察点。（二）提取物的量效关系 A375 细胞与三叶青各种提取物共培养 48h 后，用 MTT 法测定，乙酸乙酯提取物和三氯甲烷提取物在 125、625 mg/L 浓度下显著抑制了 A375 细胞活性，较空白对照组细胞活性下降了；而乙醇提取物、石油醚提取物及正丁醇提取物对细胞活性影响只在625 mg/L浓度时有影响，而在其他浓度下影响不大（P），见图 1。统计分析结果还显示，三叶青各提取物对细胞活性的抑制作用呈浓度依赖性。百度文库-好好学习，天天向上-5 图 1 三叶青提取物对人恶性黑色素瘤细胞 A375 体外抑制作用的量效观察*和空白组比较，P；*和空白组比较，P The quality-effect of the extract of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg on the inhibition of proliferation of melanoma A375 cells in vitro （三）三叶青乙酸乙酯提取物及三氯甲烷提取物作用前后 A375 细胞形态学改变 不同浓度的三叶青乙酸乙酯提取物及三氯甲烷提取物作用 A375 细胞 48h后，倒置光学显微镜观察可见，阴性对照组 A375 细胞饱满透亮，轮廓清晰，胞核、胞仁较大。而三叶青乙酸乙酯提取物及三氯甲烷提取物处理组与阴性对照组相比，细胞数量减少，部分细胞体积变小，变圆并浮起。随着药物浓度增加，细胞数量明显变少，更多细胞变成圆形，细胞表面突起多个小球状凋亡小体。图 2 空白组对黑色素瘤 A375 细胞形态学的影响 The morphological effect of blank control on melanoma A375 cells 图 3 乙酸乙酯提取物对黑色素瘤 A375 细胞形态学的影响 The morphological effect of the ethyl acetate extract on melanoma A375 cells 百度文库-好好学习，天天向上-6 图 4 三氯甲烷提取物对黑色素瘤 A375 细胞形态学的影响 The morphological effect of the chloroform extract on melanoma A375 cells 三 讨论 恶性黑色素瘤是一种恶性程度很高的皮肤癌10，其多发、易转移，目前还没有可以有效治疗黑色素瘤的药物。在癌症的治疗用药上目前仍以化学合成药为主，这些药物在杀灭肿瘤细胞的同时，对人正常细胞也有很大的损害。中国传统的医药在抗肿瘤方面显示了独有的优势，以毒副作用小而受到人们的青睐。尤其是随着科技进步和社会发展，医学模式的转变使癌症治疗将转向生物治疗、基因治疗和传统医学治疗。传统医学已先于前者取得令人瞩目的突破性进展。近半个世纪来中西医结合治疗肿瘤，已越来越被广大学者和患者接受，并逐渐受到重视，是目前恶性肿瘤综合治疗的有效手段之一。