过氧化氢酶CAT活性测定.pdf

；.过氧化氢酶活性测定-紫外吸收法 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。一、原理】H2O2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与设备与试剂】1、材料 小麦叶片等。2、仪器设备 研钵；离心机；250ml 容量瓶；移液管（0.5ml、2ml 各2支）；10ml 试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；3、试剂 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L 高锰酸钾标定）。【方法】1.酶液提取：藻液接种后每隔 1d，取 40ml 藻液（取时需摇匀），于 4，于 8 500 r/min（10 000g）下离心 10min 收集藻体，用 0.1mol/L、pH7.8 磷酸钠缓冲液 3mL 重悬浮，然后用冰浴超声破碎细胞，破碎液在 4下 10200 r/min 离心 10min,上清液即为SOD 和 CAT 粗酶液。2.酶活性测定 取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。表2-14-1 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表 管 号 S1 S2 S3 管号 S0 S1 S2 粗酶液(ml)0.2 0.2 0.2 蒸馏水/ml 1.0 1.0 1.0 pH7.8磷酸(ml)1.5 1.5 1.5 将S0号管在沸水浴煮1min 以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算：以每分钟 A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。过氧化氢酶活性 U/(g.min)=WtVVAST1.0240；.A240=AS02)(21SSAA 式中 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1,AS2样品管吸光值；Vt粗酶提取液总体积（ml）；V1测定用粗酶液体积（ml）；FW样品鲜重（g）；0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。【注】所用 H2O2溶液及 KMnO4一溶液临用前需重新标定。【注意事项】凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。