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计算机在生命科学 中的应用报告 对硫磺矿硫化叶菌p216srRNA80-709碱基片段进行PCR 扩增分析报告 前言：目前对目的基因片段进行扩增主要通过聚合酶链式反应（PCR）来完成，扩增需要模板、引物、四种脱氧核糖核苷酸、DNA 聚合酶、反应缓冲液等成分，包括变性、退火和延伸三个步骤。扩增之前，我们需要对目的基因所在的片段进行分析，找到合适的引物、模板及适当的反应体系，然后对目的基因进行大量扩增。正文：我们要对硫磺矿硫化叶菌p216srRNA80-709碱基片段进行大量扩增，完成这一目的主要包括以下几个步骤：1、对目的基因所在的DNA 序列进行酶切分析。2、将酶切后的DNA 序列进行电泳，找到目的基因所在片段。3、对目的基因所在片段进行分析，找到合适的引物及反应条件 4、对目的基因进行扩增。用到古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp 是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列，利用Vector NTI Explorer 进行分析。结果如下：上图即为目的基因所在的DNA 序列的酶切分析，由上图可以看出在第980个碱基处，有两个酶切位点，两种酶分别是BstiZ316I 和AdeI，并且这两种酶在整个DNA 序列上的酶切位点是唯一的。选其中一种酶（此处选择的是酶AdeI）对目的基因所在的DNA 序列进行酶切后电泳，结果如下：NEWMOL12389 bpAdeI(980)由电泳结果可以看出，酶切后得到两条DNA 片段，一条长1000bp 左右，一条长10000bp 左右，由于酶切位点在980个碱基处，所以长约1000bp 片段即为目的基因所在片段。用Vector NTI explorer 对 1-980碱基片段进行分析，设计 PCR 引物，结果如下：#1:Product of length 799(rating:171)Contains region of the molecule from 78 to 876 Tm:71.0 C TaOpt:49.7 C GC:29.2 Sense Primer:AAGTGAGAAAACAACTCTCTATTGG Similarity:100.0%Length:25 Tm:50.2 C GC:36.0 dH:-178.5 kcal/mol dS:-470.8 cal/mol dG:-36.4 kcal/mol Antisense Primer:GGGCTATTCTTTTGATTCACAT Similarity:100.0%Length:22 Tm:49.6 C GC:36.4 dH:-166.7 kcal/mol dS:-437.4 cal/mol dG:-34.5 kcal/mol Tm Difference:0.6 GC Difference:0.4#2:Product of length 905(rating:171)Contains region of the molecule from 78 to 982 Tm:71.3 C TaOpt:50.1 C GC:29.7 Sense Primer:AAGTGAGAAAACAACTCTCTATTGG Similarity:100.0%Length:25 Tm:50.2 C GC:36.0 dH:-178.5 kcal/mol dS:-470.8 cal/mol dG:-36.4 kcal/mol Antisense Primer:CACGTAGTGATACCGATAATTTCAATAC Similarity:100.0%Length:28 Tm:53.9 C GC:35.7 dH:-204.1 kcal/mol dS:-538.7 cal/mol dG:-41.7 kcal/mol Tm Difference:3.7 GC Difference:0.3#3:Product of length 905(rating:171)Contains region of the molecule from 78 to 982 Tm:71.3 C TaOpt:50.1 C GC:29.7 Sense Primer:AAGTGAGAAAACAACTCTCTATTGG Similarity:100.0%Length:25 Tm:50.2 C GC:36.0 dH:-178.5 kcal/mol dS:-470.8 cal/mol dG:-36.4 kcal/mol Antisense Primer:CACGTAGTGATACCGATAATTTCAA Similarity:100.0%Length:25 Tm:52.3 C GC:36.0 dH:-183.0 kcal/mol dS:-480.6 cal/mol dG:-37.9 kcal/mol Tm Difference:2.1 GC Difference:0.0#4:Product of length 903(rating:171)Contains region of the molecule from 78 to 980 Tm:71.3 C TaOpt:49.1 C GC:29.7 Sense Primer:AAGTGAGAAAACAACTCTCTATTGG Similarity:100.0%Length:25 Tm:50.2 C GC:36.0 dH:-178.5 kcal/mol dS:-470.8 cal/mol dG:-36.4 kcal/mol Antisense Primer:CGTAGTGATACCGATAATTTCA Similarity:100.0%Length:22 Tm:46.8 C GC:36.4 dH:-161.6 kcal/mol dS:-426.4 cal/mol dG:-32.7 kcal/mol Tm Difference:3.3 GC Difference:0.4#5:Product of length 798(rating:171)Contains region of the molecule from 79 to 876 Tm:71.0 C TaOpt:49.4 C GC:29.2 Sense Primer:AGTGAGAAAACAACTCTCTATTGG Similarity:100.0%Length:24 Tm:48.5 C GC:37.5 dH:-169.4 kcal/mol dS:-446.8 cal/mol dG:-34.4 kcal/mol Antisense Primer:GGGCTATTCTTTTGATTCACAT Similarity:100.0%Length:22 Tm:49.6 C GC:36.4 dH:-166.7 kcal/mol dS:-437.4 cal/mol dG:-34.5 kcal/mol Tm Difference:1.1 GC Difference:1.1 引物设计的基本原则 引物长度：15-30bp，常用为20bp 左右。引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G 和 C。引物的5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。由 引 物 设 计 原 则 对 以 上 引 物 进 行 分 析 得 最 优 引 物 序 列 为：Contains region of the molecule from 78 to 876 Tm:71.0 C TaOpt:49.7 C GC:29.2 Sense Primer:AAGTGAGAAAACAACTCTCTATTGG Similarity:100.0%Length:25 Tm:50.2 C GC:36.0 dH:-178.5 kcal/mol dS:-470.8 cal/mol dG:-36.4 kcal/mol Antisense Primer:GGGCTATTCTTTTGATTCACAT Similarity:100.0%Length:22 Tm:49.6 C GC:36.4 dH:-166.7 kcal/mol dS:-437.4 cal/mol dG:-34.5 kcal/mol Tm Difference:0.6 GC Difference:0.4 结论：由以上分析可以得出要对目的基因进行大量扩增，首先要对目的基因所在的序列用BstiZ316I 或 AdeI 酶进行切割，电泳后取长度约为1000bp 的片段进行引物设计，得到正义链引物为 AAGTGAGAAAACAACTCTCTATTGG，引物长度25，Tm值为50.2摄氏度，GC含量为36.0，反义链的引物序列为 GGGCTATTCTTTTGATTCACAT，引物长度为22，Tm值为49.6摄氏度，GC含量为36.4,。根据以上条件即可对目的引物进行大规模扩增。