测定α_淀粉酶活力的方法.pdf
.专业 word 可编辑 .实验五 激活剂、抑制剂、温度及 PH 对酶活性的影响 一、目的要求 通过实验加深对酶性质的认识，了解测定-淀粉酶活力的方法。二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约 30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和 PH 值称为某种酶作用时的最适温度和 PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH 范围内酶活力可达最高，在最适PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。食品级-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂.专业 word 可编辑 .可随机作用于直链淀粉分子内部的-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称-淀粉酶为液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支链的-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和-1,6键的寡糖。本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一）试剂及材料 1、1：30 唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以 1：30 倍蒸馏水稀释。2、0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉 0.2g，预加 20mL蒸馏水调匀，然后倒入 80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至 100mL。3、1%NaCl溶液 称取 1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至 100mL。4、1%CuSO4溶液 称取 1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至 100mL。5、标准稀碘液 称取 11g 碘，22g 碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至 500mL。吸取 2mL 上述碘液，加入 10 g碘化钾，用水稀释至 500 mL。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法 取试管 3 根，编号后按下表配置实验样液。.专业 word 可编辑 .试管序号 0.2%可溶性淀粉 1%NaCl 1%CuSO4 蒸馏水 混匀，放入37水浴中保温10min。立即加入唾液淀粉酶。1：30 唾液淀粉酶 1 2.0 mL 1.0 mL/1.0 mL 2 2.0 mL/1.0 mL/1.0 mL 3 2.0 mL/1.0 mL 1.0 mL 用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。四、温度与 PH 值对-液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料 1、2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉 2.0g（预先在 105烘干），预加 20mL蒸馏水调匀，然后倾入 80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至 100mL。2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液 （1）0.2 mol/mL Na2HPO4 称取 35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至 100mL。（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的 PH 值。3、供试酶液的制备 称取固体-液化淀粉酶 1.00g，加入 PH6.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液 100mL(缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在 5-10min内完成)，于 40恒温水浴中活化 0.5小时，然后用 3000rpm/min离心机离心分离 5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。.专业 word 可编辑 .4、标准比色液 甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾 0.4748 g，溶解并定容至500mL。乙液：称取铬黑 T 40.00mg，溶解并定容至 100mL。使用时取甲液 40.0mL、乙液 5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用 7天后重新配置。5、标准稀碘液。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法 1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。2、不同温度对-液化淀粉酶活力的影响 取 4 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号 1 2 3 4 2%可溶性淀粉 20.0mL 20.0mL 20.0mL 20.0mL PH6.0缓冲液 5.0mL 5.0mL 5.0mL 5.0mL 把四根试管分别放入 50、60、70、80恒温水浴中预热 10min 分别加供试酶液 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 反应完成时间记录（min）50 60 70 80 .专业 word 可编辑 .加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有 2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。3、不同 PH 值对-液化淀粉酶活力的影响 取 5 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号 2%可溶性淀粉 缓冲溶液 恒温水浴 60预热10min。供试酶液 反 应 完 成 时 间 记 录（min）1 20mL PH4.0 5.0 mL 0.5 mL 3 20mL PH6.0 5.0 mL 0.5 mL 4 20mL PH7.0 5.0 mL 0.5 mL 5 20mL PH8.0 5.0 mL 0.5 mL 其它操作与温度对酶活力影响实验相同。五、结果计算和讨论 淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g酶制剂 1 小时内液化可溶性淀粉的克数。酶活力单位(U/g)=nt5.0102.02060 式中：20可溶性淀粉的用量（mL）；.专业 word 可编辑 .t 酶解反应完成所需的时间（min）；0.5测定时稀释酶液用量（mL）；0.02可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）；n 酶制剂稀释倍数 1、不同温度对-液化淀粉酶活力影响的结果记录 实验结果 50 60 70 80 酶活力（U/g）2、不同 pH 值对-液化淀粉酶活力影响的结果记录 实验结果 pH4.0 pH6.0 pH7.0 pH8.0 酶活力（U/g）分别以PH 值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制PH 值酶活力单位、温度酶活力单位图。讨论分析实验结果。六、思考题 1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？.专业 word 可编辑 .3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？
