动物生理学实验指导书.pdf

目录 生理学常用实验仪器和手术器械的认识-实验前教育 1 实验一 反射弧的分析 7 实验二 坐骨神经-腓肠肌标本的制备和骨骼肌的特性9 实验三 刺激的极性法则14 实验四 鱼类血红蛋白含量测定15 实验五 红细胞比积（比容）的测定17 实验六 红细胞的溶解溶血作用19 实验七 白细胞机能的实验观察21 实验八 鱼心期前收缩和代偿间歇22 实验九 蛙类离体心脏灌流23 实验十 蛙类心脏的神经支配28 实验十一 蛙肾小球血流的观察 30 实验十二 迷走神经对鱼胃运动的影响 31 实验十三 鱼类肾小管的主动运输 34 实验十四 胰岛素致低血糖效应 36 实验十五 抗利尿激素（ADH）对蟾蜍膀胱水转运的影响 37 实验十六 腺垂体激素对蛙体色和生殖的影响 38 附录 常用生理溶液的配制 40 1 生理学常用实验仪器和手术器械的认识-实验前教育 一 分组（每班分成 6 组或 8 组，每组人数视班级总人数而定）二 设备的管理 采取登记使用制度，具体方案由实验室管理办公室制定。三 实验课的目的和要求 动物及鱼类生理学既是一门理论性学科，也是一门实验性学科。它的理论和概念都是根据实践观察和科学实验中总结出来的，它的发生和发展都离不开科学实验，因此，实验课在生理学中占有重要的地位，实验课的目的在于：（一）了解获得生理学知识的科学方法，加强理论来源于实践的认识。（二）熟悉和掌握生理学实验的一般方法及基本操作技能。（三）亲自动手，直接验证理论，加深印象，以巩固理论知识。（四）在实验中训练严谨的科学作风和实事求是、一丝不苟的科学态度，加强辨证唯物主义的观点。（五）培养科学的思维方法和独立地分析问题、解决问题的能力。为达到以上目的，要求同学们必须做到以下几点：（一）实验前认真做好准备 1仔细阅读实验指导，了解当次实验的目的和要求、方法和步骤，牢记注意事项。2结合实验内容认真复习和掌握有关理论，预测各项实验应得的结果和可能产生的误差。（二）实验时严肃认真 1实验器材的放置力求整齐、清洁、有条不紊，方便于操作。2按照实验步骤循序操作，严格遵守操作规程，正确使用各种仪器和药物。3以小组进行的实验，每项观察前，小组成员应分工明确，在统一指令下配合行动，以减少不必要的误差。4仔细观察，准确记录各项实验结果，边观察、边思考该结果产生的原因、机理及生理意义。5切实执行实验室守则。（三）实验后及时总结 1将实验器材洗净擦干，并整理就绪，请教师验收。2将实验记录到的实验结果加以归纳、分析，从中找出一般性、规律性的现象，与所学理论进行对照，对客观真理加以肯定，对伪象和误差加以分析说明，按实验报告的写作要求，认真独立地用统一的实验报告纸写好实验报告，并按时交报告。四 实验报告的规范（一）姓名 班别 组别 日期（二）实验号和题目（三）实验目的（四）实验对象（五）实验方法和步骤：如果按现成的实验指导进行，则不必描述。如果是自行设计的实验则应详细叙述。（六）实验结果：是实验报告的 基本部分，是进行科学分析和作出科学结论的依据。必须将实验过程所观察到的现象忠实、详细、准确地记录下来。如果实验中出现的结果与预测的结果不符时，应如实将实验结果记录下来，不得凭主观对结果进行取舍。进行实验时应即时记录，不能凭记忆记录实验结果，否则则容易发生差错和遗漏。实验结果按不同的需要应进行分析和整理，凡属测量性质的结果，如高低、长短、快慢、轻重、多少等，均应以正确的单位和数值定理，如呼吸以次/分为单位；凡可以用曲线记录的实验结果，尽量用曲线记录，要求记录曲线完整、清晰，在曲线上要标志说明，有刺激前的 2 对照，刺激时的反应和刺激去除后的恢复过程，要有刺激记号、刺激参数和时间记号等；有些实验测量出的结果为了便于比较、分析，可用表格或绘图表示。对上述实验结果的数据、图、表，还可以用文字进一步描述其变化情况和规律，描述过程要客观，切忌主观臆断。记录生理学实验结果的图、表，每人均应独立作出。图应有自明性。图的内容包括图的名称，图的各部分含义。表亦应有自明性。（七）分析讨论：对实验结果的分析讨论是实验报告不可缺少的部分，是感性认识提高到理性认识的必要手段。这是作者进行独立思考、独立分析问题和解决问题的结果，不同作者对于同样的结果可以有不同的理解，进行不同的分析，得出不同的结论。所以每个人均应有自己的讨论，不得抄袭。讨论可以根据已知的理论知识对实验现象进行分析；或者从实验中获得规律性内容，经总结上升为理论，切忌盲目抄书，如遇到已知理论不符的情况时，应分析其可能原因，在可能的条件下，最好提供出进一步验证的证据。（八）结论：是从本实验结果的分析综合中归纳出带规律性、概括性的判断，所以总结中不应罗列具体结果，更不要写进本实验未能证实的内容。结论应是实验结果所说明的概原则或理论的简明总结。实验报告的书写是富有创造性的工作，应严肃认真。五 实验室守则（一）不迟到早退，不大声喧哗，不到处走动，不做与实验无关的事，实验时有事外出或早退应向教师请假。（二）认真做好是眼前准备，实验时认真操作，实验过程仔细观察、准确记录。（三）爱惜器材、节约实验动物和药品，各组使用本组的器材、不与其他组调换。如需要可向教师要求添加或调换器材，仪器要按操作规程使用，如遇损坏或失灵，应及时报告带班教师，不得自己乱修。损坏东西要登记赔偿。（四）保持实验室整洁。实验动物尸体不可乱丢，桌上污有血迹时应及时抹干净。实验结束后，安排值日生打扫清洁，必须关好水、电、门窗后才能离开实验室。六 常用仪器和手术器械的认识 （一）手术器械 在生理学实验中使用的手术器械，基本上与人用手术器械相同。现将蛙、鱼类常用手术器械简介于下：1剪刀 手术剪用于剪肌肉、筋膜和结缔组织等；眼科剪用于剪神经、血管和浆膜等细软组织；普通剪或金冠剪用于剪骨或皮肤等粗硬组织。2镊子 手术镊子用于夹住或提起组织和牵提切口处的皮肤，以便于剥离、剪断或缝合；眼科镊子用于夹捏神经、血管和浆膜等细软组织。3金属探针 用于破坏蛙或蟾蜍脑和脊髓，或破坏鱼的脊髓。4玻璃针 直形和有钩的，用于分离神经和血管组织等。5锌铜弓 用于对神经肌肉标本施加刺激，以检查其兴奋性。6蛙心夹 用于夹住蛙或鱼心尖，并和张力传感器连接。7蛙板和蛙钉 二者配合用于将蛙体或鱼体固定。8杯 小杯子用于盛任氏液或鱼用生理溶液。大杯子用于盛污物。9注射器和针头 配合用于注射各种药物、溶液或抽血等。此外，在哺乳类动物手术器械中还常用：手术刀（用于切开皮肤和肌肉），止血钳（用于分离皮下组织，夹钳血管止血和提起皮肤切口。蚊式止血钳较小，适用于分离小血管及神经周围的结缔组织）。动脉夹（用于阻断血管血流）、缝针（一般直针用于缝合皮肤，弯针用于缝合深层组织）、气管插管（急性动物实验时，用于插入气管，以保证气道畅通）、三通开关（急性动物实验时，用于插入动脉的塑料管与血压换能器的连接，并能通过侧孔注射抗凝剂）、动静脉插管（静脉插管用于静脉注射药物和溶液，动脉插管测量动脉血压用）等。3（二）SuperLab 生理实验教学系统 1原理 信号 1 标本 信号 2 换能器 信号 3（电刺激，由电脑输出）（肌肉收缩）（曲线，由显示器输出）请注意，信号 3 的曲线虽然表现了肌肉收缩的特性，但其本身并非机械曲线，而是它的一种表现形式。2使用方法 硬件：四个通道（一个张力通道、一个压力通道，二个生物电通道），一个刺激输出，一个计滴输出。软件：（1）登录界面：普通用户直接确定，不需输入密码。（2）菜单栏 4 文件菜单：用来新建实验、打开历史实验、保存实验、保存配置、打开配置、退出实验等。编辑菜单：用来删除、复制、粘贴操作。视图菜单：用于设置界面的形式。设置菜单：用于设置工作方式和计时器清零。工作方式包括信号采集和数据回放两种。工具菜单：提供对计算器、记事本、画图、Microsoft Word、Microsoft Excel等工具的连接。窗口菜单：包括标记创建窗和标记查找窗。帮助菜单：提供智能帮助和有关产品的信息。（3）工具栏 提供菜单栏里有关选项的快捷方式。鼠标置于图标上时会出现相应的文字提示。（4）选取通道 通道 1 为张力通道，通道 2 为压力通道，通道 3 和通道 4 为生物电通道。点击表示相应的小灯泡，将使通道在屏幕上显现和隐藏。（5）灵敏度调节 只需调节张力一项。定标不可随意更改。对换能器的定标在出厂时已经完成并进行了加密，用户不能对此项进行设置。（6）扫描速度调节 SuperLab 屏幕右下角的两个手指则只能用来调节幅度和波宽的比值，对幅度没有影响。它可以用来调节扫描的速度。（7）刺激参数设定 “间隔”或叫刺激间隔，意指相邻两个刺激之间的时间间隔；串数指的是一个主周期内有几串脉冲，有几串脉冲串数就为几，比如，在一个主周期内有 2 串脉冲，则串数就为 2，因为只有在刺激模式为“主周期”的情况下此选项才高亮显示；“脉冲个数”即一串脉冲中有多少个刺激。“增量”一词只在刺激模式为“间隔渐变”/“幅度渐变”/“波宽渐变”的条件下才有意义。“初始值”5 也一样。设置刺激参数要注意相邻两串脉冲不可距离过近，否则将会引起标本疲劳。这一点可以通过适当设置延时加以调节。此处各术语的含义如下图所示。图 1 电子刺激器的波形及其参数 延迟（延时）：设置来自本机主间隔触发或者外部触发电脉冲到产生刺激电脉冲之间的时间，即刺激同步输出刺激波输出之间的产生一定的时间延迟，用于刺激脉冲引起的动作电位显示在屏幕上的适合位置，便于观察和分析。波宽：指刺激脉冲的作用时间。串间隔：指的是双脉冲或串内脉冲之间的时间间隔。主间隔：控制整机输出脉冲（包括刺激电脉冲和触发电脉冲）的总周期，即设置重复刺激脉冲的时间间隔。（8）刺激和信号记录 6 软件界面下方的刺激按钮用来向标本施加电的刺激。按一下施加刺激，按两下取消刺激，依此类推。信号记录和暂停按钮在软件界面左下方。3注意事项 （1）定标 定标不可随意更改。对换能器的定标在出厂时已经完成并进行了加密，用户不能对此项进行设置。（2）换能器使用完毕后，必须将盖子拧紧。（3）SuperLab 生理信号记录系统中，时间可以由系统自动测量，但不能自动控制。（4）其他。7 实验一 反射弧的分析 【目的要求】分析反射弧的组成部分，并探讨反射弧的完整性与反射活动的关系。【基本原理】反射是指在中枢神经系统参与下，机体对刺激所产生的反应过程。反射活动的结构基础是反射弧，包括感受器、传入神经、神经中枢、传出神经和效应器五部分。本实验利用稀硫酸为刺激物，刺激“脊蛙”（只保留脊髓的蛙或蟾蜍）的后肢足趾皮肤，以引起“脊蛙”的屈腿动作作为出现反射活动的指标。分别在破坏该反射的反射弧各个环节之前、后进行实验，然后根据每一组的实验结果进行分析。【动物与器材】蛙或蟾蜍。蛙手术器械一套，支架、肌夹，大烧杯、培养皿，硫酸（0.5或1），纱布，探针，玻璃分针。【方法与步骤】1.“脊蛙”的制备 用探针在蛙枕骨大孔处插入，或短脑与脊髓联系后毁脑，保留脊髓。然后用肌夹夹住下颌，将肌夹固定于支架上，将“脊蛙”悬挂起来，准备进行以下实验。图 2 制备好的脊髓动物 2用培养皿盛少量的 0.5或 1硫酸溶液，让蛙右后肢较长的脚趾尖浸入硫酸溶液中（约浸 1-3 个脚趾即可），观察“脊蛙”是否出现屈腿动作，一经出现屈腿动作，立即用盛自来水的大烧杯浸洗掉脚趾皮肤上的硫酸，并用纱布将水揩干（如下图）。图 3 实验示意图 8 3将浸过硫酸的右后肢脚趾皮肤剥去，在重复上一项实验（注意，硫酸溶液切勿碰到未剥皮的脚趾）。观察蛙腿有无反应，对比两项实验结果，说明了什么？4用硫酸溶液浸泡右后肢未剥皮的脚趾是否出现屈腿动作？用水洗脚趾并揩干。5在右后肢大腿背侧沿坐骨神经方向将皮肤剪开，在股二头肌和半膜肌之间找出并分离坐骨神经，用玻璃分针挑起，再用眼科剪小心地将其剪断（注意：不要剪断与之并行的血管，以免出血）。重复上一项实验，观察是否出现屈腿动作，并对比 4、5 两项实验结果。6用硫酸溶液浸泡左后肢脚趾皮肤，观察是否出现屈腿动作，然后用水洗脚趾并揩干。7用探针插入脊髓椎管内，将脊髓捣毁，再重复上一项实验，是否有反应？对比 6、7 两项结果。注意事项：1注意实验的顺序；2剥皮操作是剥去脚趾皮肤，而不是后肢皮肤；3左右后肢应分辨清楚，不可随意颠倒；4第一步操作是毁去脑，而不是同时毁去脊髓；5用酸刺激后，应尽快洗净脚趾上残留的硫酸，并用纱布擦干；6使蛙的皮肤保持湿润。每一项试验应在蛙安静时进行；7两相相互对比的实验，脚趾浸入硫酸的深度应尽量一致；8如不出现屈脚动作，而酸刺激已达1min 之久，即可视为无反应，不应继续刺激，以免烧伤皮肤。作业：综述每组实验结果，进行分析讨论。最后作出反射弧的完整性与反射活动有什么关系的结论。9 实验二 坐骨神经-腓肠肌标本的制备和骨骼肌的特性 【目的要求】1学会制备神经肌肉标本的方法；2通过电刺激，观察不同刺激强度与骨骼肌收缩力量的关系；3进一步观察刺激强度不变时，改变刺激频率对肌肉收缩的影响，了解骨骼肌收缩特点。【基本原理】1坐骨神经腓肠肌标本（神经肌肉标本）是从蛙（或蟾蜍）后肢取下的坐骨神经及其支配的腓肠肌制成，该标本所需的存活条件比较简单，易于控制和掌握，因此，常用来观察神经冲动、兴奋性、兴奋过程及骨骼肌收缩特点等。2整块肌肉对刺激的反应不具有“全或无”现象，而是在一定范围内肌肉的收缩力量随刺激强度增大而增加，这是由于肌纤维兴奋性高低各不相同的缘故。阈刺激时，少数兴奋性高的肌纤维先收缩，超过最大刺激强度时，收缩力不再增加。3肌肉接受一次刺激产生一次收缩，称为单收缩。如果使二个相继刺激作用于肌肉，而第二个刺激正好落在第一个刺激所引起肌肉收缩的舒张期或缩短期内，结果引起肌肉收缩总和，收缩曲线呈现不同程度的叠加。当刺激频率增加到某一限度时，表现为不完全强直收缩和完全强直收缩。【实验材料和器材】蛙，蛙手术器械（粗剪刀、普通手术剪、眼科剪、普通手术镊、眼科镊）、蛙板、探针、玻璃分针、图钉、丝线、肌动器、铁架台、双凹夹、培养皿、烧杯、滴管、任氏液、锌铜弓、SuperLab 生理信号记录系统）。【方法和步骤】1基本步骤 （1）制备兴奋性良好的坐骨神经-腓肠肌标本，置任氏液中备用。坐骨神经-腓肠肌标本的制作方法见后面。（2）标本在肌动器上的装置方法如图所示。先将标本的股骨插入电极旁的小孔内，并旋紧固定螺丝将股骨固定，把结扎跟腱的线系于换能器的受力点上，使线保持拉直状态。标本的坐骨神经搭在电极上。肌动器固定于支架上。（3）肌动器和 SuperLab 生理信号记录系统的连接方法如图所示。SuperLab 生理信号记录系统的刺激输出线接肌动器的刺激电极。图 4 刺激与反应实验装置 10 （4）阈收缩与阈上收缩 采用刺激模式：单刺激。调节刺激强度从最小逐渐增加（0.11.0V），测定肌肉开始出现的微弱收缩，即阈收缩，并记录收缩曲线。停止后再记录一段后，按上述方法，继续增加刺激强度。每刺激一次，肌肉的收缩反应幅度增高一次，此即阈上收缩。（5）单收缩 选用屏幕扫描速度 2000:1，选择适当的阈上刺激进行单刺激，即描记出单收缩曲线。（6）不完全强直收缩与完全强直收缩 选择同样屏幕扫描速度和同样的强度进行阈上刺激。选择刺激模式“主周期”或“串刺激”，逐渐加大刺激频率，分别记录不同频率（如 1，2，5，10，20，50Hz）时的肌肉收缩曲线，观察收缩曲线的变化。每次刺激时间约 12 秒，然后让肌肉休息片刻。由于刺激频率不同，肌肉将先后出现单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩。2刺激参数的设置（以下考虑到时间限制，只进行刺激频率的实验）实验中波宽统一采用 2ms 刺激参数的设置为：波宽 2ms 幅度 0.5V 刺激间隔 对串刺激和主周期模式有意义，由 200ms 到 20ms（200ms，100ms，50ms，20ms），单刺激无意义。刺激个数 由 1 到 50（1，2，5，10，20，50），指的是一个串内的刺激个数，刺激个数为 1 或者 2 时，不能形成收缩复合。刺激个数为 1 和 2 时，选择刺激模式“单刺激”（刺激个数为 2 时，也可以选择刺激模式“串刺激”，此时间隔为 500 ms）；刺激个数为 550 时，原理上选择刺激模式“主周期”或“串刺激”均可，但考虑到主周期模式有多串刺激，可能造成标本的疲劳，故本实验采用串刺激模式。延时 20ms。（此处，刺激间隔=间隔，主周期=总周期=主间隔）时间的控制 SuperLab 生理信号系统中，时间可以由系统自动测量，但不能自动控制。实验结果的记录 由于本实验室暂时没有打印机，故结果需自行画出。（SuperLab 生理信号系统可以保存图片，但是考虑到操作上的复杂，仍采用手画的方式作图）【注意事项】1在制备神经肌肉标本时，应动作迅速。任氏液虽然与蛙的体液成分相似，但毕竟不同，时间太长仍然会影响标本兴奋性；2制备标本时操作应精确和细心，动作要轻，以免损伤标本的神经和肌肉，尤其不能强力牵拉神经和剪伤神经、肌肉，避免直接手触神经和肌肉；3注意保留股骨，跟腱处结扎要牢固；4丝线应与换能器的弹簧片保持垂直；5实验过程中，要不断滴加任氏液以免标本干燥，但肌动器上不能残留过多任氏液，以免造成刺激电极短路；6每做一个实验之前，必须做好刺激参数的设定；7记录时注意注明刺激参数；8实验完毕时，注意检查和整理物品，尤其注意把换能器上的盖子拧好。实验安排 11 1先在各自的实验室制备标本，每组一只蛙。标本制备成功后，进入机房进行记录，每组一台机；实验各组按机器编号对号上机。2各组成员应注意分工，以提高效率和避免失败。3实验完毕后，各组桌面上的物品自行整理，并做好卫生，将器材送回准备室，铁架台可留在机房；值日生打扫室内清洁。坐骨神经-腓肠肌标本的制备 【实验材料和器材】蛙，蛙手术器械（粗剪刀、普通手术剪、眼科剪、普通手术镊、眼科镊）、蛙板、探针、玻璃分针、图钉、丝线、培养皿、烧杯、滴管、任氏液、锌铜弓。【方法与步骤】1破坏脑和脊髓 左手持蛙，用食指向下压其吻部，拇指按压背部，使头部尽量前俯，右手持探针沿头背正中线向尾端触滑，在两侧耳后缘连线前约 3mm 处可触到凹陷处即枕骨大孔部位，可将探针由此处垂直刺入皮肤到达椎管。再将针尖转向前方插入颅腔，并左右搅动捣毁脑组织，然后将探针退出至刺入点皮下，针尖转向尾侧，捻动探针使逐渐插入整个脊椎管内，捣毁脊髓。此时，如蛙呼吸动作消失，四肢松软，即表示脑和脊髓完全破坏（如下图）。图 5 蛙类双毁髓法 2制备粗制标本 右手握住蛙后肢，在骶髂关节水平以上约 1cm 处，右手拿粗剪刀剪断脊柱，并将头和前肢连同所有内脏剪去弃于烧杯内。然后用左手拇指及食指捏住脊柱断端，右手捏住断端边缘皮肤，向下剥掉全部后肢皮肤。将此粗制标本放入盛有任氏液的培养皿中。洗净双手和用过的器械。12 图 6 剥去后肢皮肤的方法 3分离两腿 左手捏住脊柱断端将标本提起，背部朝上，尾端上翘，两后肢下垂，用粗剪刀沿水平方向在泄殖孔上方剪去凸出的尾杆骨，然后沿中线将脊柱剪成左右两半，再从耻骨联合中间剪开两侧大腿（为保证两侧坐骨神经完整，向下剪时应避免偏向一侧）。将已分离的标本浸入盛任氏液的培养皿中。4游离坐骨神经 取一条后肢腹侧向上放在蛙板上，先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经，然后背侧向上，用图钉固定于蛙板上。用眼科镊子夹住位于坐骨神经上方的梨状肌及其周围的结缔组织，并轻轻提起，用眼科剪小心剪断（注意，进剪方向始终与神经干平行，可避免伤及神经）。再在背侧股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟内，用玻璃分针纵向分离暴露坐骨神经（如下图）。神经完全暴露后，用粗剪刀剪下一小段与神经相连的脊椎。用镊子提起此块脊椎，以眼科剪剪去坐骨神经干上的分支，一直游离至膝关节处。图 7 分离坐骨神经法 13 5完成坐骨神经腓肠肌标本 将以游离的坐骨神经搭在腓肠肌上，在膝关节周围剪断大腿肌肉，并用粗剪刀将股骨刮干净，不要在股骨下端坐骨神经周围残留过多的破碎肌肉组织，距膝关节约 1cm 处剪断股骨。用玻璃分针或眼科镊子在腓肠肌跟腱下方穿孔，并穿线结扎，保留一段线，在结扎处下端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，并逐步游离至膝关节处。要防止剪伤腓肠肌肌膜和该肌的神经分支，小心保留腓肠肌起点与骨的联系。然后在膝关节下将小腿其余部分全部剪去。留下的便是带有脊椎的坐骨神经腓肠肌标本（如下图）。图 8 蛙坐骨神经-腓肠肌标本 6检查标本的兴奋性 取锌铜弓在任氏液中浸湿后接触坐骨神经，如腓肠肌发生灵敏的收缩，表明标本性能正常，将此标本放入新鲜的任氏液中待用。14 实验三 刺激的极性法则 【目的要求】掌握刺激的极性法则。【基本原理】使用直流电刺激可兴奋细胞，之所以能使细胞产生兴奋，从根本上讲是电刺傲改变了细胞原来膜内外之间的电位差。细胞的静息膜电位为外正内负，如果刺激使膜电位差值减小（去极化），细胞则兴奋；如果使膜电位差值增大超极化），细胞则兴奋性降低（抑制）。因此在细胞膜外使用直流电刺激细胞，通电时兴奋只发生在负极，正极的兴奋性下降；在持续通电期问不形成刺激；断电时产生反向电流，兴奋只发生在正极；通电的刺激强度大于断电。刺激神经干最简单的方法就是使用锌钢弓。锌铜弓在溶液中沾湿以后，锌的表面电离出正离子里面形成负离子；而铜的表面电离出负离子，里面形成正离子。当锌铜弓接触活组织时，电流便沿肴锌一活组织一铜的方向流动而产生刺激效应。所以锌相当于正极，而铜相当于负极发挥刺激作用。当断开时，则发生相反的效应。使用锌钢弓就可以在剥离的蟾蜍坐骨神经干（也可在在体的蟾蜍神经干）上进行这一实验。方法步骤：1在坐骨神经腓肠肌标本（具体制作方法见实验二）的神经干中间部位用干棉线结扎，以阻断其传导兴奋的能力。2用锌铜弓跨越结扎线结刺激坐骨神经干。使锌极在腓肠肌一端刺激，观察腓肠肌收缩发生在通电（接触神经干）时还是断电（离开伸经干）时。3调转锌铜弓的极性，使铜极在腓肠肌一端刺激，观察腓肠肌收缩发生在通电时还是断电时。注意比较实验步骤 2 和 3 引起腓肠肌收缩的强度是否一样，哪个收缩强度比较大？4可以多个同学手拉着手串联起来，第一个同学用锌钢弓的铜极接触结扎线结一端的神经干，最后一同学拿另一只锌铜弓用锌极接触扎线结另一端的神经干，即使中间有 5 个以上同学拉手串联起来也能得到良好的实验效果。5解释各项实验结果。注意：1用锌铜弓刺激时，一定要使神经干悬空，且勿接触其他物体。2如果神经干结扎不好，通电和断电时都会引起腓肠肌收缩，需重新结扎。15 实验四 鱼类血红蛋白含量测定 【目的要求】掌握鱼类血红蛋白测定的原理和方法。【基本原理】测定血红蛋白含量的方法有多种。最常用的是沙利氏比色法。其原理是将少量稀盐酸加入一定量血液，使血红蛋白的亚铁血红素变为高铁血红素，使溶液呈现稳定的棕黄色。用水稀释后与标准色管比较，即可直接读出每100ml 血液中所含的血红蛋白克数。【动物与器材】鱼，血红蛋白计（Shali 氏）1 套，0.1molL 盐酸（或 1盐酸）、蒸馏水、95酒精，乙醚、滴管、小玻棒、棉球。沙利氏血红蛋白计主要有吸血管、比色计和比色管等部件（下图）。吸血管为一厚壁毛细玻璃管，其上有一20mm3（即 20l）的刻度，尾端膨大，上面套上顶端有孔的橡皮帽或套上胶管，供吸血用。比色计的一侧（或两侧），装有标准色玻璃管，比色管则可插在比色计中。与其一侧（或两侧）的标准色进行比色。比色管的两侧有两行刻度，一行为血红蛋白量的绝对值，表示每 100ml 血液中所含血红蛋白克数（g%），由 2至 20 为止；另一行为血红蛋白相对值，表示相当正常平均值的百分比（%）。由 20 起至 160止。人用的比色计是以 100ml 血液中含有血红蛋白 14.5g 为 100。本实验以绝对值（g/%）来表示为宜。图 9 血红蛋白计【方法与步骤】1用滴管吸取 0.1mol/L 盐酸，滴 56 滴入刻度比色管内（约加到管下端刻度 2 处）。2采血。鱼类采血方法多种，可采用尾静脉采血法。将鱼用 0.01MS222 或 0.5氨基甲酸乙酯（乌拉坦）浸浴麻醉（或不麻醉）后，用 2ml 注射器套上针头从尾柄腹侧插入，当血液上升到针头时，取下针筒，直接在针头上吸取所需血液。必要时可从心脏直接采血，但这种方法会使心脏受到损伤而不适宜继续的和多次取血样。用吸血管吸取鱼血至 20mm3（即20l）刻度处（要准确）。将管尖端外面的血液拭去。3将吸血管迅速插入刻度比色管底的盐酸中，徐徐滴血于液体底层，并利用上层的盐酸将吸血管洗涤多次（避免起泡），使管内壁血液全部进入溶液中。取出吸血管后，轻轻摇动比色 16 管，使血液与盐酸充分混合，静置 10 分钟，使管内盐酸和血红蛋白作用完全，形成棕色的高铁血红蛋白。4用滴管将蒸馏水逐滴加入比色管中，每加一滴后应摇匀或用小玻棒搅匀，常观察比色管内颜色，直到色度与标准玻璃的色度相同位置（应在自然光下比色）。5取出刻度比色管，观察并记录下管内溶液凹面最低处的刻度数字，即为每 100ml 血液中血红蛋白的克数。【注意事项】1采血操作要迅速、准确，不能凝血（必要时可用 1%肝素钠或其他抗凝剂处理注射器），也不能有气泡，否则须弃去重采。2吸管使用后，必须立即洗涤，并晾干；3血红蛋白计的吸血管很容易损坏，应妥加爱护。管内有凝血时不可用金属丝疏通，可浸入 1%氨水或 45%尿素溶液中（本实验采用的是氨水）；4血液与盐酸作用的时间不可过短，必须在 10 分钟后方可稀释比色，否则血红蛋白不能充分转变成为高铁血红蛋白。作业：记录被测鱼的血红蛋白含量（g%），进行分析讨论。说明：1 血红蛋白含量测定实验用的旧吸血管刻度为 20CMM，其含义为 20MM3（20CMM，20 cubic mm）吸血时吸至此刻度；2 采血时从鱼的尾部体侧稍微偏向腹侧进针，方向指向脉脊，并刺入脉棘下静脉中；3 沙利氏血色素计的原理：在与标准色相同的情况下，溶液的总体积与血红蛋白的含量成正比。关于沙利氏血色素计的原理，可以使学生自行思考。17 实验五 红细胞比积（比容）的测定 【目的要求 学习测定红细胞比容的方法。【基本原理 将抗凝血装于分血管（也称分血计 Hematocrit，常用的是 Wintrobe 管）或微量毛细取血管，在一定条件下离心沉淀，由此可测出红细胞占全血体积的百分比，此即红细胞比积（比容）。此时，管中的血液分为三层上层为淡黄色的透明液体血浆；中层为极薄一层的呈灰白色的白细胞和血小板，下层为被挤压很紧的暗红色的红细胞。目前临床上应用了微量毛细管比容法。也可采用商品化的专用肝素化（抗凝）毛细玻璃管，采血后加热毛细玻璃管两端或以橡皮泥封口，在小型专用的超速离心机上离心5min，转速至少在 10000 r/min，然后在红细胞压积测定板上读出体积百分比。也可采用更为先进的电阻抗微量比容法等方法测定红细胞比容。【动物与器材】家兔、注射器(2 ml 或 5ml)、离心机（最好采用直角离心机）,Wintrobe 管、细长的滴管、小试管、碘酒棉球,75%酒精棉球、双草酸盐抗凝剂（配制见【附 1】）【方法与步骤】1温氏管（Wincrobe 管）管长 110 mm，内径约 2.5mm，内径必须均匀，管底平坦。管的两侧标有 cm 和 mm分格刻度，右侧数由下而上，最下部为零，最上部为 10；左侧数反之，它们分别供读取比容和血沉用下图）。图 10 Wincrobe 管 2抗凝小试管的制备 吸取双草酸盐抗凝剂 0.2 rnl，置于小试管内，并使该抗凝剂均匀分布于小试管内壁上，烘干备用，此管可扰凝 2 ml 血。3采血 采用家兔心脏穿刺法（见【附 2】），用干燥、消毒的注射器抽取血液 2ml，置于已用双草酸盐抗凝的小试管内，充分混匀。4离心 18 以细长的滴管伸入比容管内，沿管壁将抗凝血液准确加到比容管上端刻度 10 处（自右侧计数），切勿混入气体。配平后，按 3 000 r/min,离心 30 min。5计算红细胞比容 取出比容管直接读数，若红细胞柱的高度为 45 mm，则红细胞比容为 45 容积。【注意事项】1红细胞压积容积管必须清洁干燥。2应透用不影响扛细胞体积的抗凝剂，故以双草酸盐为好。3离心条件尽可能恒定。4防止出现溶血现象（有溶血者血浆呈红色)。【思考题】1哪些因素可以影响红细胞比积（比容）？2如何防止溶血？3急性失血 300 ml 后，红细胞比容有何变化？为什么？【创新与探索】设计测定人体红细胞比容的实验。【附 1】双草酸盐抗凝剂配制：草酸铵（能沉淀在血凝过程中所必须的 Ca2+，但可使红细胞略膨大）1.2g 草酸钾（能沉淀在血凝过程中所必须的 Ca2+，同时可使红细胞略缩小）0.8g 40%甲醛溶液（防止霉菌等微生物生长）1.0ml 蒸馏水 加至 100 ml【附 2】家兔心脏穿刺法采血：将兔背位固定，剪去左侧胸部相当于心脏部位的被毛，用碘酒或者酒精消毒皮肤，选择心脏跳动最明显处作穿刺。一般由胸骨左缘外 3mm 处刺入兔的第 3 肋间隙。穿刺时，最好用左手触诊心脏，以作配合。当针头接近心脏时，就会感到心脏的跳动，这时需将针头再向里穿刺，便可进入心室。由于心脏的搏动，血液会自动进入注射器。如认为针头已经进入心脏，但抽不出血液，可把针头稍微退出或前进一些。心脏采血经 6-7 天后，可以重复进行。采血量：在兔一次可取血液 20-25ml。19 实验六 红细胞的溶解溶血作用【目的要求】1学习引起红细胞溶解的各种实验方法。2观察红细胞的溶血现象。【基本原理】红细胞在高渗氯化钠溶液中，会失去水分发生皱缩；在低渗氯化钠溶液中，会因过多水分进人红细胞而膨胀，甚至破裂使血红蛋白释出，此即红细胞溶解。红细胞对低渗溶液具有不同的抵抗力，这种抵抗力与红细胞表面积体积比值有关，也即红细胞有不同的渗透脆性，表面积体积比值小者抵抗力小（渗透脆性大）；反之，抵抗力大（渗透脆性小）。各种有机溶荆、酸、碱等都会使红细胞膜发生溶解或破坏，血红蛋白释出，此即红细胞的化学性溶血。发生溶血后，残留的红细胞膜碎片被称为“血影”。【动物与器材】家兔、离心机、5 ml 试管（12 支）、试管架、吸耳球、2ml 吸管、注射器（2 ml 或 5 ml)、针头(6 号或 6.5 号）、滴管、0.9氯化钠溶液、0.1 mol/L 盐酸溶液、0.1 mol/L 氢氧化钠溶液、乙醚或氯仿、3.8柠檬酸钠溶液、75酒精棉球、171 mmol/L 氯化钠溶液（配制方法见【附1】）。【方法与步骤】方法 1：渗透性溶血红细胞渗透脆性的测定 (1)配制不同浓度的低渗氯化钠溶液 取12支试管，分别按下表加人171 mmol/L 氯化钠溶液和燕馏水。表 1 红细胞渗透脆性实验操作表 试管号 试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 171mmolL-1 氯化钠溶液/ml 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 蒸馏水/ml 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 氯化钠溶液的终浓度/mmolL-1 116.3 109.4 102.6 95.8 88.9 82.1 75.2 68.4 61.6 54.7 47.9 41 氯化钠溶液的最终百分浓度/%0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.24 (2)采用兔耳中央动脉采血法（具体方法见【附 2】）。用干燥的注射器及针头静脉取血 1-2ml，立即通过 6 号针头滴人各管中，每管一滴，轻轻摇匀后于室温下静置 2h 后观察各试管之溶血情况。也可用生理盐水配制 5%红细胞混悬液代替静脉血进行此步实验。5%红细胞混悬液制备方法见本实验方法 2。(3）结果判断 从高浓度管开始观察：不溶血：上层浅黄、透明，下层红色、不透明；开始溶血：上层红色、透明，下层红色、浑浊而不透明；完全溶血：全部液体变红且透明。20 方法 2：化学性溶血 (1)5%红细胞混悬液制备 取兔血 2 ml(方法见实验 3-3)，加人盛有 3.8%柠檬酸钠溶液0.2ml 的离心管中，充分混合，放人离心机中，按 3 000 r/min，离心 5 min。取出后，弃去上清液，加人生理盐水，混合后再离心，然后再弃去上清液。同法重复一次，即得洗涤之红细胞。用生理盐水配成 5红细胞混悬液。(2）取试管 4 支，各盛 5%兔红细胞混悬液 2.ml，分别加人下列溶液，并观察红细胞在各试管中的溶解现象：1)0.9氯化钠溶液 1.0 ml 2)乙醚或氯仿 0.2ml 3）0.1 mol/L 盐酸溶液 1 ml 4）0.1 mol/L 氢氧化钠溶液 1 ml(3)半小时后，观察并记录各试管溶液溶血情况，注意颜色与透明度。【注意事项】1试管编号排列顺序切勿弄错、颠倒。2在进行渗透性溶血红细胞渗透脆性的测定时，要求所吸氯化钠溶液和蒸馏水的量要准确、无误。3加人血液后，轻轻摇匀溶液，切勿剧烈振荡。4应在光线明亮处观族结果必要时吸取试管底部悬液一滴，在显微镜下观察。【思考题】1为什么在获取活细胞进行细胞培养的科研实验或在医学临床上需用各种生理盐水溶液？2产生渗透性溶血和化学性溶血的机制有什么不同？3如何判定红细胞最大脆性和最小脆性？4红细胞温育渗透脆性实验的基本原理是什么？有什么意义？【创新与探索】试设汁一个仅借光学显微镜区分等渗溶液和等张溶液的实验方法。【附 1】171mmolL 氯化钠溶液的制备：氯化钠 1.0 g 蒸馏水 1000 ml【附 2】兔耳中央动脉采血法：将兔置于兔固定箱内，用酒精棉球擦揉兔耳片刻，使其充血。在兔耳中央有一条纵行、较粗、颜色鲜红的中央动脉。用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央动脉的末端，沿动脉平行地沿向心方向刺入动脉，轻轻抽动针筒，即可见血液进入注射器。一次可采血约 15ml（采血后应注意止血）。采血一般使用 6 号针头，不可太细。需要注意的是，兔耳中央动脉易发生痉挛性收缩，因此，采血前必须使兔耳充血。当动脉扩张，未发生痉挛性收缩前立即进行抽血，时间过长，动脉会发生较长时间的收缩，采血难以进行。21 实验七 白细胞机能的实验观察【目的要求】1学习观察白细胞机能的方法。2观察白细胞运动机能与吞噬功能。【基本原理】白细胞的主要机能之一是变形运动与吞噬活动。白细胞通过变形运动，从毛细血管壁进人 组织液并吞噬浸人机体的细菌和异物等以达到对机体的防御与保护作用。【动物与器材】蛙或蟾蜍、普通显微镜或倒置显微镜、注射器与针头、凹槽载玻片、盖玻片、移液管、棉球、任氏液、墨汁（深蓝色墨水或含有洋红的生理溶液）。【方法与步骤】1白细胞变形运动的观察 在蟾蜍或蛙躯体的一侧皮肤剪开一个小口，将移液管的下口插人皮肤的剪口内，深深地插人皮下淋巴囊（如后背部的后淋巴囊）中，吸取足量的淋巴液，然后将移液管中的淋巴液滴一小滴于盖玻片上，再将盖玻片翻转置干载玻片的凹槽中，使淋巴掖形成悬垂状的液滴。将带有悬垂淋巴液滴的载玻片置于显微镜下进行观察。可以看到淋巴液中的白细胞进行缓慢的变形运动。因其变形运动十分缓慢，故观察者可以在显微镜下绘出白细胞变形运动的图形。如果将带有淋巴液悬垂滴的载玻片靠近电灯泡，由于电灯泡释放的热量影响淋巴液悬垂滴中的细胞，可使其中的白细胞的变形运动明显加快。2白细胞吞噬运动的观察 在进行实验的前一天，向蟾蜍或蛙的背部淋巴囊注人 0.40.5 ml 墨汁也可用深蓝色墨水成含有洋红的生理盐水溶液）。注射后，蛙或蟾蜍机体会发生防御反应，其主要反应之一是白细胞吞噬染料颗粒。在第二天进行实验时，可用带有针头的注射器从蟾蜍或蛙的淋巴液中抽出一些淋巴液，将抽出的淋巴液滴一小滴于载玻片上，然后将此载玻片放在显微镜下，观察淋巴液中白细胞的形态。可观察到淋巴液中的白细胞吞噬染料颗粒的现象。如果将此淋巴液涂片经甲醇固定，亚甲蓝染色，则被吞噬到白细胞胞内的染料小颗粒会显得更加明显。【思考题】1白细胞的变形运动与吞噬功能有什么生理意义？2患急性细菌性炎症时，中性粒细胞数量为什么增多？【创新与探索】根据白细胞变形运动与吞噬功能的原理，试想出用其他动物的血液观察白细胞变形运动与吞噬功能的实验方法。22 实验八 鱼心期前收缩和代偿间歇 【目的要求】观察心脏对额外刺激的反应，了解心肌在兴奋过程中兴奋性的周期性变化，掌握心脏活动的描记方法。【基本原理】心肌细胞每发生一次兴奋后，