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2023年植物组织培养技术在藏药中的应用研究进展梁翠婷，刘 兰，刘 继，旦增顿珠，张勇仓*(1.西藏大学 医学院，西藏 拉萨 850000； 2成都市农林科学院，四川 成都 611130) 藏药作为我国四大民族药之首，发展至今已有两千多年的历史，藏药因其独特的用药风格及疗效，深受人们信赖。藏药品种丰富，据文献记载共有植物药2 685种，其中菌类50种，地衣类6种，苔藓类5种，蕨类118种，裸子植物47种，3变种，被子植物1 895种，141变种，另有动物药159种，矿物药80余种1-2。尽管我国藏药资源丰富，但近年来，随着藏医药产业发展，市场对藏药的需求量逐渐增加，致使藏药被无规划地大量采挖，加之其生长环境地处高原，常年降雨量较少，气温低等原因，使得藏药具有生长缓慢、资源量少、物种分布不均等特点，因此许多藏药在市场上供不应求，甚至成为濒危物种。目前已有74种藏药被列入中国珍稀濒危植物，其中，一级濒危藏药11种，二级濒危藏药21种，三级濒危藏药42种3-4。因此，既保护好藏药的现有资源，又能满足市场需求就成为亟待解决的问题，针对这一情况，有学者提出了对藏药资源进行定期普查、就地保护、建立藏药种质资源库、开展人工种植、加强民众对藏药的保护意识等相关解决方法4-5。植物组织培养指在无菌条件下，将植物的离体器官，如根、芽、茎、叶等外植体接入至培养基中，通过人为控制生长环境，对离体器官进行培养，外植体经过脱分化、再分化、诱导生根形成完整植株的一系列过程。自1920年德国植物学家Haberlandt提出细胞具有全能性学说至今，植物组织培养技术已日趋成熟，并被广泛应用于农业、花卉业、药用植物等多个领域6-7，因该技术具有繁殖系数高，缩短育种周期，快速获得目标物等优点，无疑是解决当前濒危藏药资源短缺问题的有效手段8。近年来，植物组织培养技术在藏药植物中的应用日益增多，本研究从该技术在藏药研究中的应用、藏药组织培养体系建立途径、影响因素、存在问题等方面进行综述，为今后藏药的抢救性保护和可持续发展提供参考。1.1 通过组织培养技术获得大量无菌植株藏药植物因长期适应高寒缺氧环境，形成了种群更新较慢的特点，加之气候复杂多变，环境荒漠化等使其生存环境易受到破坏，造成藏药资源量减少的困境9，而组织培养技术具有繁殖系数高的优点，可在一定程度上获得大量植株10。泽仁旺姆对藏药白花秦艽进行组织培养，筛选出最好的分化培养基，繁殖系数高达2 00011。杨爽等12以一级濒危藏药鸡蛋参的嫩茎为实验材料发现，当添加ZT(玉米素)的浓度为2.0 mg/L时，鸡蛋参腋芽的增殖系数达到4.86，在继续添加了NAA 0.05 mg/L，ZT 1.0 mg/L的培养基中对腋芽进行培养，此时无菌苗增殖系数达到了5.44。曾钰婷等13在螃蟹甲的组织培养研究中发现，螃蟹甲的无菌苗在添加了不同浓度的6-BA培养基中培养，单株植株可分化出37个植株，进一步诱导生根可获得生长健康的完整植株。这些研究为缓解藏药资源的稀缺状况奠定了一定基础。1.2 通过组织培养技术获得活性成分藏药材的活性成分种类丰富，但在整体植株中的占比较少，且很多藏药材资源量稀少，因而从保护性开发角度看，提高藏药材中活性成分无疑是保护藏药的又一有效途径5。近年来，众多科研人员致力于提高藏药材的活性成分，王莉等14以林芝地区的长鞭红景天为材料研究发现，以MS培养基为基本培养基，添加6-BA 5.0 mg/L，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸) 0.1 mg/L的条件最适宜长鞭红景天细胞生物量的生长，以及次生代谢物的合成。郭志刚等15先采用固体培养基诱导藏红花愈伤组织，再将愈伤组织转移至液体培养基中快速合成藏红花素，该方法克服了愈伤组织形成过程中，藏红花素抑制细胞生长的缺点，又实现了藏红花素的快速生物合成。研究发现，通过添加壳聚糖、壳寡糖、茉莉酸甲酯、水杨酸等对藏红花中藏红花素合成的影响发现，添加了100 mol/L的茉莉酸甲酯组藏红花素的含量达到28.57 mg(1 g干细胞计)16。2.1 间接器官发生途径间接器官发生指通过对外植体进行愈伤组织诱导，再经过脱分化形成不定芽，通过不定芽的增殖，进一步诱导生根，驯化形成完整植株的过程17-18。濒危藏药自身材料较难获得，而间接器官的发生途径不局限于某个外植体，可选任何组织进行培养诱导，这极大降低了取材困难程度，因此在濒危藏药组织培养中，多数以间接器官进行培养。李展等19通过以藏药纤毛婆婆纳的顶芽为材料，MS为培养基，在添加6-BA 0.5 mg/L和NAA 1 mg/L时纤毛婆婆纳愈伤组织诱导率达95%。李茜茹等20在当药的组织培养中，以嫩芽为外植体，MS为培养基，通过添加ZT 0.3 mg/L、2，4-D 2.1 mg/L，愈伤组织诱导率达83%。陈序昉等21以多刺绿绒蒿的嫩叶为外植体，以MS为基础培养基，添加NAA 0.1 mg/L和6-BA 1 mg/L为诱导多刺绿绒蒿愈伤组织的最适宜组合。霍丽云等22以高寒藏药白花假龙胆的胚轴、幼叶及未成熟种子为外植体诱导愈伤组织发现，添加了2，4-D 3.0 mg/L和KT 0.5 mg/L的MS培养基中愈伤诱导率达到最高，将愈伤组织进行继代培养，再经过诱导生根等可获得无菌苗。直接器官发生是通过对具有生长点的外植体进行诱导，直接形成不定芽，不经过脱分化形成愈伤组织的步骤。直接器官发生建立组织培养体系较快，可直接获得不定芽，通过不定芽的增殖，达到组织培养过程中增殖系数倍增的目的17。毕丽伟等23以鸡蛋参的茎段为外植体，1/2 MS为基本培养基，通过添加6-BA 0.5 mg/L和IBA 0.2 mg/L直接诱导出芽，再接入生根培养基诱导生根，从而获得鸡蛋参的无菌苗。泽仁旺姆等24以拉萨夺底沟的藏紫草茎尖为材料，在MS培养基中添加了6-BA 0.5 mg/L与IBA 0.5 mg/L，此时藏紫草的不定芽增殖系数为5，再对不定芽进行继代和生根培养，可获得藏紫草的完整植株。徐文华等25以马尿泡芽为外植体，在MS培养基中添加6-BA 2 mg/L和NAA 1 mg/L时芽的分化率为100%，继续进行生根培养即获得完整植株。3.1 外植体选择不同植物所选择的外植体部位有所不同，外植体是否诱导成功，是组织培养能否顺利进行的关键。徐文华等26在对唐古特大黄进行组织培养的研究中发现，唐古特大黄的子叶、下胚轴、胚根和幼根均可进行分化。钟世浚等27在添加了ZT的MS培养基中对红花龙胆的叶片及带节茎段进行筛选，发现白花龙胆的叶片严重褐化，但带节茎段则可进行增殖产生不定芽。王慧春等28对濒危藏药独一味进行了组织培养研究发现，在以嫩芽、子叶、幼根为外植体时，幼根在添加了2，4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L的MS培养基中的诱导率高达93.5%。作者对现有文献进行了整理，将藏药中常用外植体的部位，以及所需的培养基与激素种类归纳见表1。表1 外植体类型及培养条件3.2 消毒方法虽已有研究人员进行了开放式培养研究，但绝大多数植物组织培养仍需无菌条件。而藏药的生存环境复杂，一般在野外获取，通常携带有大量的微生物或内生菌，如何将外植体携带的病原微生物清除干净，是组织培养的关键，综合相关文献看，常用的消毒剂主要为次?a href=" target="_blank" class="keylink">人崮啤然热芤骸话悴街栉仍诹魉陆巴饣竦玫闹参锿庵蔡逅又是逑锤删唬僭谖蘧跫掠?5%乙醇进行3060 s消毒，无菌水冲洗35次，最后用氯化汞、次氯酸钠等消毒剂对外植体进行消毒处理，以无菌水冲洗干净。对于较难消毒的外植体，采用联合消毒的方法可取得较好的除菌效果，如在消毒剂中加入吐温，可增加消毒剂与外植体表面接触的概率，使消毒更彻底28，32，36。研究发现，在常规灭菌前用紫外线照射，可明显降低污染率。藏药的组织培养中常用消毒剂及消毒时间见表2。表2 消毒剂类型3.3 培养基及培养条件培养基是植物组织培养时外植体的主要营养来源，培养基成分为大量元素、微量元素、铁盐元素及有机物，常用的培养基有MS、1/2 MS、1/4 MS、B5、White等，其成分与细胞生长速度关系密切，如Manuhara等41发现培养基中添加蔗糖相较于对照组，可加速细胞的生长速度，而适当添加氮源则有利于植物中生物量的积累42。对现有藏药组织培养文献进行归纳发现，藏药的组织培养在诱导愈伤组织及丛芽分化时期，通常以MS培养基为主，在诱导生根时期以1/2 MS为主(见表3)。在植物组织培养中，激素的种类和配比与外植体的生长方向、生理反应及生长分化有关17，藏药组织培养中常用的激素类型有6-BA、NAA、KT、IBA等。现将部分濒危藏药组织培养的培养基及培养条件归纳如表3所示。光照、温度、pH等与植物细胞的生长及次生代谢的合成关系密切，也可在一定程度上影响细胞的生物积累量43-44。表3 部分濒危藏药植物离体培养条件3.4 内生菌在某些藏药的组织培养中，内生菌除了起促进种子萌发的作用外，还在植物器官的形成中发挥着重要作用，如兰科植物，其种子缺乏胚乳等萌发所需的营养物质，只有在合适的菌种侵染下才有可能萌发52。GAO Y等53在濒危兰科藏药手掌参的根系中分离出了角担菌属菌株，将其与手掌参种子共同培养发现，23 d后种子突破种皮形成原球茎，而没有角担菌参与共培养的手掌参种子始终未萌发，其原因在于手掌参种子通过消化角担菌的菌丝获得营养以供萌发生长。天麻也为珍贵的兰科药用植物，其种子的萌发亦需要菌株参与。1980年，研究人员首次分离出有助于天麻种子萌发的菌株“京陕807-02号”，接着又连续分出对天麻萌发有影响的12种担子菌小菇属真菌菌株54，这为西藏天麻的人工快速繁育提供了一定理论依据。童文君55从野生美花石斛根、茎、叶分离得到14株生真菌与67株内生细菌，发现这些菌株具有解无机磷和解有机磷、解钾及产生长素的能力； 将一株兼具三种促生长特性的芽孢杆菌DLB20作用于不同株高美花石斛组培苗中发现，当接种浓度为106 cfu/mL时更有利于组培苗的生根，这表明此菌株有一定的促进美花石斛组培苗生长的潜力。因此，内生菌也成为一些藏药组织培养的重要影响因素。 4.1 外植体较难获取西藏地域辽阔，气候复杂，造就了丰富的藏药资源物种，但其生态环境易受破坏且不易恢复，因而藏药资源更加珍稀5，同时也加大了采药难度，如冬虫夏草等濒危物种采挖极其困难，且只有在国家规划许可条件下方可进行采收； 手掌参繁殖方式主要为无性繁殖，繁殖系数极低，自然更新缓慢，野生资源易遭到破坏，加之从可采收至枯萎的时间仅几个月，采集可进行组织培养的外植体则极为困难56。 4.2 褐化褐化指在组织培养的过程中，酚类物质氧化成褐色的醌类物质，形成的醌类物质抑制酶活性，愈伤组织形成受阻，进一步使外植体褐化死亡57。植物的褐化与自身的基因型、外植体的生理状态、培养基的种类等息息相关58-59。杨爽等60以濒危藏药手掌参芽部为试验材料，探究了消毒时间、活性炭浓度、Vc(维生素C)使用方法、暗培养时间等因素对手掌参外植体褐化的影响，结果发现，75%酒精消毒20 s，0.1%氯化汞消毒10 min，Ac(活性炭)1.0 g/L，Vc 2.0 mg/L，先暗培养510 d，每3 d转瓶一次，2 000 Lx光照下培养时，手掌参的褐化程度最低。袁丽红等61以藏红花的球茎、无菌芽和幼叶为外植体进行组织培养研究发现，球茎的褐化率最低，且连续转瓶可降低褐化程度。叶耀辉等50在桃儿七的组织培养中发现，通过添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和Vc均可减少褐化，在早期添加 Ac1 g/L，后期添加 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)1 g/L 的组合培养下，褐化程度最低。4.3 污染外植体的污染常与外植体自身携带的病原菌，以及实验人员不规范的操作有关62。常见污染为细菌污染、真菌污染、病毒污染63及植物自身所带的内生菌污染。细菌污染可通过添加庆大霉素、先锋霉素、氯霉素等杀菌剂抑制细菌生长。真菌污染可在外植体消毒处理时选择合适的消毒剂，如漂白粉、氯化汞、过氧化氢、次氯酸纳等加以解决。在使用真菌和细菌抑菌剂时均需考虑是否对外植体的生长产生影响，刘兰等30在对濒危藏药喜马拉雅紫茉莉的组织培养中发现，在培养基中添加50 mg/L多菌灵可抑制真菌生长，添加25 mg/L青霉素可抑制细菌生长，且这些浓度下的抑菌剂对外植体的生长无不良影响。植物的内生菌可存在于植株的所有部位，其在植物的生长过程中具有增强宿主抗逆性和抗病害等作用64。在某些植物的组织培养过程中，内生菌的存在使外植体常出现增殖率低、生长缓慢、玻璃化严重等问题65，而手掌参、天麻、桃儿七等多种藏药的生长又依赖内生菌，如何合理解决内生菌的污染与生长依赖问题，对于此类藏药的组织培养成功与否至关重要。4.4 炼苗驯化困难在植物组织培养过程中，炼苗决定着植株是否能适应人工气候箱外的自然环境。徐元江等40对藏药匙叶翼首草芽与根茎进行了组织培养和快繁方面的研究，选取生长健壮的苗株，打开瓶口炼苗3 d，取出无菌苗洗净根部培养基，分别种植于3种栽培基质(蛭石：珍珠岩； 蛭石：腐殖土：珍珠岩； 蛭石：菜园土：珍珠岩)，研究发现翼首草再生苗炼苗与移栽过程可通过控制水分，添加抗菌剂如多菌灵等方法增加存活概率。在藏药的组织培养中，应注意藏药的生活习性特点，尽量使藏药的组培苗培养生长环境与自然环境接近，以适应西藏特殊的气候环境66。 综上，目前藏药植物组织培养技术的应用可在短期内获得大量无菌植株，可一定程度解决藏药资源量瓶颈问题，并可能定向获得较大量的目标活性成分67。藏药取得外植体后需要进行合适的消毒处理，既需考虑彻底灭菌，也应兼顾对外植体存活率及生长状态的影响。藏药组织培养中常用MS培养基诱导愈伤组织、丛芽增殖等，以1/2 MS诱导植株生根。常用的激素有 6-BA，NAA，KT，IBA等。不同藏药培养的光照条件、温度及pH也不尽相同，需根据不同植物加以调整。在藏药的组织培养中还存在取材较困难、褐化及污染等问题。内生菌的存在影响藏药材在组织培养中的繁殖率，存活率同时又是部分藏药种子萌发的必要条件，需权衡解决。多种藏药已建立起完整的离体培养体系，植物组织培养技术在藏药保护中的应用日益成熟，但藏药组培苗如何炼苗驯化，以更好地适应人工气候箱外的环境，应是重点考虑的问题之一，此外组织培养与野生藏药活性成分的差别也值得关注。随着组织培养技术的不断发展，必定可以有效缓解当下藏药资源稀缺的问题，推动藏药向着可持续、产业化、规模化方向发展。 猜你喜欢 藏药外植体培养基 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