基因工程原理教学课件.ppt

肖璐肖璐基因工程原理基因工程原理Principle of Gene Engineering绪论绪论三大重中之重高技术三大重中之重高技术l生物技术（生物技术（BT)l信息技术（信息技术（IT）l新材料技术（纳米技术，新材料技术（纳米技术，NT）1.生物技术概念与特征生物技术概念与特征l定义：定义：利用活体生物或它们的产物来生产或修饰利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品以改良植物和动物、或发展具有特一种产品以改良植物和动物、或发展具有特殊用途的微生物的技术。殊用途的微生物的技术。l特征：特征：21世纪最具潜力的高新技术世纪最具潜力的高新技术多学科、交叉、综合的技术多学科、交叉、综合的技术影响最为深远最广泛的技术影响最为深远最广泛的技术3.生物技术的基础生物技术的基础lDNA操作技术操作技术l基因组计划：人类基因组和其他生物基因组计划：人类基因组和其他生物基因组计划基因组计划l蛋白质组蛋白质组l生物信息学生物信息学l下游支撑技术与手段下游支撑技术与手段4.生物技术的类别生物技术的类别l传统生物技术：制酒、制醋、制豆瓣传统生物技术：制酒、制醋、制豆瓣l工业生物发酵技术：抗生素发酵、氨基工业生物发酵技术：抗生素发酵、氨基酸发酵等酸发酵等l现代生物技术现代生物技术5.生物技术的内容生物技术的内容l基因工程技术基因工程技术l蛋白质工程技术蛋白质工程技术l细胞（组织）工程技术细胞（组织）工程技术l酶工程技术酶工程技术l发酵工程技术发酵工程技术基因工程基因工程(geneengineering)常和以下名称混用常和以下名称混用:l遗传工程遗传工程(geneticengineering);l基因克隆基因克隆(genecloning);l分子克隆分子克隆(molecularcloning);l基因操作基因操作(genemanipulation);l重组重组DNA技术技术(recombinationDNAtechnique)l克克隆隆(clone):作作名名词词时时指指含含有有某某目目的的DNA片片段段的的重重组组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系分子或含有该重组分子的无性繁殖系.l作动词时是指基因的分离与重组过程。作动词时是指基因的分离与重组过程。基因工程技术及其应用基因工程技术及其应用5.2蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念在基因工程技术对编码蛋白质的基在基因工程技术对编码蛋白质的基因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。的和更有效的蛋白质。5.3细胞（组织）工程概念细胞（组织）工程概念利用工程学原理进行细胞生物学的基利用工程学原理进行细胞生物学的基础研究和制造使用活细胞的产品，如组础研究和制造使用活细胞的产品，如组织工程和生物加工工程。前者是利用移织工程和生物加工工程。前者是利用移植的细胞、骨架、植的细胞、骨架、DNA、蛋白质或蛋白蛋白质或蛋白质片段替代或修复已受伤或损坏的组织质片段替代或修复已受伤或损坏的组织和器官；后者是和器官；后者是利用活细胞生产生物医利用活细胞生产生物医药产品。药产品。组织工程组织工程人造器官人造器官干细胞：干细胞：1999年年4月，月，美国的科研人员美国的科研人员首次成功地从成年人骨髓的干细胞在体首次成功地从成年人骨髓的干细胞在体外培养分化出软骨、脂肪和骨骼细胞。外培养分化出软骨、脂肪和骨骼细胞。标志着干细胞的研究取得了重大进展。标志着干细胞的研究取得了重大进展。以这项技术为代表的组织工程的以这项技术为代表的组织工程的突破具有广阔的应用前景，在不远的将突破具有广阔的应用前景，在不远的将来为实现人造来为实现人造“器官器官”成为可能。成为可能。酶工程的主要内容酶工程的主要内容l酶的分离纯化酶的分离纯化l酶与细胞的固定化技术及反应器酶与细胞的固定化技术及反应器l酶制剂的发酵生产酶制剂的发酵生产l酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造l酶抑制剂与激活剂开发与研究酶抑制剂与激活剂开发与研究l人工设计与合成模拟酶及酶分子人工设计与合成模拟酶及酶分子5.6发酵工程概念发酵工程概念发酵工程属于生物技术的下游技发酵工程属于生物技术的下游技术，是工业化大规模培养细胞、生产术，是工业化大规模培养细胞、生产生物制品的一种技术。生物制品的一种技术。传统的发酵工程主要用于微生物。传统的发酵工程主要用于微生物。现代生物技术还包括动物、植物细胞现代生物技术还包括动物、植物细胞和工程菌的发酵培养。和工程菌的发酵培养。发酵工程技术发酵工程技术l发酵对象：发酵对象：传统微生物发酵、基因工程菌发酵、动物传统微生物发酵、基因工程菌发酵、动物细胞培养细胞培养、植物细胞培养植物细胞培养l发酵类型：发酵类型：液体发酵、固体发酵、固定化培养、流式液体发酵、固体发酵、固定化培养、流式发酵发酵l发酵技术设备发酵技术设备6 生物技术的应用领域生物技术的应用领域l医药：医药：生物制药；基因治疗；人工器官生物制药；基因治疗；人工器官l农业和畜牧业农业和畜牧业转基因植物转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新：抗病虫害新品种、抗逆新品种、品种、高品质新品种高品质新品种转基因动物转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的：生产有用蛋白质和高品质的畜产品畜产品生物反应器生物反应器：利用动植物细胞或组织作为：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质生物反应器，直接生产有用蛋白质生物技术的应用领域生物技术的应用领域l轻工与食品轻工与食品新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶l环境环境污染治理；废物利用；污染物生物降解污染治理；废物利用；污染物生物降解生物制药产业化特点生物制药产业化特点l高技术高技术：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透l高投入高投入：在国外，一个生物药品平均要投入：在国外，一个生物药品平均要投入13亿美亿美元，并随着开发难度的增大元，并随着开发难度的增大,有逐步增高的趋势有逐步增高的趋势l长周期长周期：国际上，一个新的生物药品需要：国际上，一个新的生物药品需要68年时间年时间l高风险高风险:一个新药品的开发，经过一系列的程序一个新药品的开发，经过一系列的程序-研发、中试、动物实验、研发、中试、动物实验、IIII期临床实验，上市和期临床实验，上市和严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃尽弃l高回报高回报:开发成功一个新的生物药品开发成功一个新的生物药品,回报很高。回报很高。如美国如美国Amgen公司，首次开发上市的公司，首次开发上市的EPO、G-SCF到到1997年的销售额分别接近和达到年的销售额分别接近和达到20亿美元亿美元8基因工程试剂的高回报基因工程试剂的高回报l碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子231元元/ugl红细胞生成素红细胞生成素1072元元/ugl白细胞介素白细胞介素-2410元元/ugl巨细胞粒细胞集落刺激因子巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元元/ugl胰岛素胰岛素10.2元元/mg全球生物科技公司前全球生物科技公司前10名名（1999年）年）公司名称公司名称市值（亿美元）市值（亿美元）98年收入（亿美元）年收入（亿美元）Amgen41627遗传技术研究公司遗传技术研究公司18510生物遗传研究公司生物遗传研究公司1185Elan894Immunex712Medimmune562希龙希龙506Alza436Centocor423Genzyme387世界主要生物药品年销售额世界主要生物药品年销售额 （亿美元亿美元亿美元亿美元）EPO16.5葡萄糖脑苷酯酶葡萄糖脑苷酯酶2.15抗抗CD3MAb0.8人白细胞介素人白细胞介素20.40凝血因子凝血因子VIII2.5-干扰素干扰素7.00G-CSF9.36-干扰素干扰素2.55GM-CSF0.41-干扰素干扰素0.04tPA3.0人生长激素人生长激素4.50B型肝炎疫苗型肝炎疫苗10.0人胰岛素人胰岛素7.00 美国生物制药产品种类及数量美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种类疾病种类产品数量产品数量疾病种类疾病种类产品数量产品数量感染性疾病感染性疾病39心脏病心脏病26神经系统疾病神经系统疾病28呼吸系统疾病呼吸系统疾病22艾滋病及相关疾病艾滋病及相关疾病19自主免疫系统疾病自主免疫系统疾病19皮肤病皮肤病19移植移植13消化系统疾病消化系统疾病11遗传疾病遗传疾病11血液疾病血液疾病9糖尿病及并发症糖尿病及并发症7不育症不育症5眼病眼病3生长发育不良症生长发育不良症3骨质疏松骨质疏松2妊娠预防妊娠预防2肿瘤疾病肿瘤疾病1759中国基因工程制药中国基因工程制药l200多家生物技术公司多家生物技术公司l生物技术药品产值：生物技术药品产值：1996-18亿元；亿元；1997-30亿元；亿元；2000-72亿元亿元l可生产药物品种：约可生产药物品种：约20种种 国内产业化生物药品概况国内产业化生物药品概况产品种类产品种类临床临床I临床临床II临床临床III批准上市批准上市凝血因子凝血因子VIIIXVIII细胞刺激因子细胞刺激因子SCFTPOG-CSF,M-CSF,EPO生长因子生长因子骨形成因子骨形成因子肌营养因子肌营养因子FGF，GM-CSF胰岛素类似物胰岛素类似物血小板衍生因子血小板衍生因子HGHEGF干扰素干扰素IFN,1b,1b,2a,n3,1b,1b白介素白介素1,13,6,2,4,1211激素激素人促卵泡素人促卵泡素甲状旁腺素甲状旁腺素胰高血糖素胰高血糖素胰岛素，心钠素胰岛素，心钠素降钙素降钙素促黄体生成素促黄体生成素IGF-1甲状腺刺激素甲状腺刺激素酶酶羧肽酶羧肽酶尿酸氧化酶尿酸氧化酶葡萄脑苷酯酶葡萄脑苷酯酶脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶链激酶链激酶疫苗疫苗CEAHSV,流感病毒流感病毒LymeHBV，HCV其他其他水蛭素水蛭素松弛素松弛素,HB,SODTNF，tPA，白蛋白白蛋白,杀菌蛋白杀菌蛋白单克隆抗体单克隆抗体可溶性补体受体可溶性补体受体I型型中国生物医药产业化问题中国生物医药产业化问题l缺乏创新、仿制产品缺乏创新、仿制产品l重复过多、水平不高重复过多、水平不高l投入不足、少而分散投入不足、少而分散l产权保护意识淡薄产权保护意识淡薄l质量管理落后质量管理落后l支持技术落后支持技术落后l药政管理滞后药政管理滞后生物技术产业化生物技术产业化农业领域农业领域l已有已有35个科个科120多种植物获得转基因植物，一多种植物获得转基因植物，一些重要的农作物获得商品化的转基因品种。些重要的农作物获得商品化的转基因品种。l种植面积迅猛发展。种植面积迅猛发展。l采用的基因正在从抗除草剂、抗菌素、抗病采用的基因正在从抗除草剂、抗菌素、抗病虫害基因到抗逆境、高品质方向发展。虫害基因到抗逆境、高品质方向发展。l由单个质量性状基因向多基因数量性状转变。由单个质量性状基因向多基因数量性状转变。l植物反应器生产稀有蛋白。植物反应器生产稀有蛋白。世界转基因作物大田释放情况世界转基因作物大田释放情况(1987.1-1998.4)转基因作物特性转基因作物特性批准项数批准项数所占比例所占比例抗除草剂抗除草剂129729.6%抗虫抗虫104623.8%提高产品质量提高产品质量88620.2%抗病毒抗病毒4369.9%改善农学性状改善农学性状2114.8%抗真菌病抗真菌病2084.7%其他其他3036.9%总计总计4387100%中国已获准进入大田的转基因植物中国已获准进入大田的转基因植物（1998.3)转基因植物总项数转基因植物总项数48转基因植物种类转基因植物种类15抗除草剂抗除草剂3抗虫抗虫16抗病抗病16提高品质提高品质2改善农学性状改善农学性状1其他其他10转基因作物种植面积转基因作物种植面积生物技术与传统中药生物技术与传统中药l中药现代化中药现代化核心是建立与现代基因学说相应的现代中药核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论理论l现代中药理论的建立现代中药理论的建立确立中药与基因表达的关系确立中药与基因表达的关系中药药靶中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找（基因）或作用位点基因的寻找中药化学组中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分中药临床药效中药临床药效的科学评价与分析方法的科学评价与分析方法l生物技术的应用生物技术的应用中药基因组中药基因组利用现代生物技术研究分析中药对人体（细利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因表达（蛋白质）的影响。胞）基因表达（蛋白质）的影响。技术平台技术平台：大规模基因表：大规模基因表达分析（基因芯片、达分析（基因芯片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立息数据库的建立中药化学组中药化学组利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、动力学。物代谢、动力学。技术平台技术平台：色谱及色谱：色谱及色谱-质谱，色谱质谱，色谱-波谱，波谱，波谱波谱-波谱联用等分析技术与层析、临界萃取等分离技术波谱联用等分析技术与层析、临界萃取等分离技术中药新剂型中药新剂型基因工程的诞生基因工程的诞生 l基因工程诞生于1973年，它是数十年来无数科学家辛勤劳动的成果、智慧的结晶。从40年代开始，科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。l概括起来，从40年代到70年代初的基因工程诞生，在现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用理论上的三大发现理论上的三大发现 l（1）40年代发现了生物的遗传物质是年代发现了生物的遗传物质是DNA。l（2）50年代搞清楚了年代搞清楚了DNA的双螺旋结的双螺旋结构和半保留复制机理。构和半保留复制机理。l（3）60年代确定了遗传信息的传递方年代确定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的，式。确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。个氨基酸。技术上的三大发明技术上的三大发明 l（1）限制性核酸内切酶的发现）限制性核酸内切酶的发现l（2）对基因工程技术的突破的另一发对基因工程技术的突破的另一发现是现是DNA连接酶的发现连接酶的发现l（3）基因工程载体的发现）基因工程载体的发现基因工程的里程碑l1973年，斯坦福大学的SCohen等人，也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌(EColi)的抗四环素(TCr)质粒PSCl01和抗新霉索(Ner)及抗磺胺(Sr)的质粒R6一3，在体外用限制性内切酶EcoRI切割，连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中，选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。1953年，年，Watson,Crick确定确定DNA双螺旋结构，获双螺旋结构，获1962年诺贝尔生理、医学奖。年诺贝尔生理、医学奖。1955年，英国生物化学家年，英国生物化学家Sanger确定牛胰岛素结确定牛胰岛素结构，获构，获1958年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。1965年年,首次人工合成结晶牛胰岛素首次人工合成结晶牛胰岛素-中国中国1973年年,基因重组技术建立基因重组技术建立.(美美)1980年，年，Sanger和和Gilbet设计出测定设计出测定DNA序列的序列的方法，获方法，获1980年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。1984年，化学奖，年，化学奖，BruceMerrifield（美国），美国），建立和发展蛋白质化学合成方法。建立和发展蛋白质化学合成方法。l1994年，生理、医学，年，生理、医学，AlfredG.Gilman（美国）（美国），发现，发现G蛋白及其在细胞内信号转导中的作用。蛋白及其在细胞内信号转导中的作用。KargB.Mullis(美美)发明发明PCR方法。方法。l1996年，克隆羊诞生年，克隆羊诞生l1997年年,保罗保罗博耶博耶和约翰和约翰沃克发现沃克发现“能量分能量分子子”三磷酸腺苷的形成过程获三磷酸腺苷的形成过程获Nobel化学奖化学奖l1998年，生理、医学，年，生理、医学，RolertF.Furchgott（美（美国），发现国），发现NO是心血管系统的信号分子。是心血管系统的信号分子。l2001年年,人类基因组计划完成人类基因组计划完成l2004年年,阿龙阿龙切哈诺沃、阿夫拉姆切哈诺沃、阿夫拉姆赫什科和欧赫什科和欧文文罗斯发现了泛素调节的蛋白质降解。罗斯发现了泛素调节的蛋白质降解。2008年，美国年，美国WoodsHole海洋生物学实验室的海洋生物学实验室的下村修下村修（OsamuShimomura）、）、哥伦比亚大学的哥伦比亚大学的MartinChalfie和加州大学圣地亚哥分校的和加州大学圣地亚哥分校的钱永健（RogerYonchienTsien）因发现并发展了）因发现并发展了绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖）而获得该奖项。项。2009年，美国科学家年，美国科学家ThomasA.Steitz（托马斯托马斯施泰茨）和以色施泰茨）和以色列女生物学家列女生物学家AdaE.Yonath（阿达（阿达约纳特）因在约纳特）因在核糖体核糖体结构和结构和功能研究中的贡献共同获该奖。功能研究中的贡献共同获该奖。2010年，英国科学家罗伯特年，英国科学家罗伯特爱德华兹，爱德华兹，因试管婴儿获该奖因试管婴儿获该奖基因工程的基因工程的内容一、本门课程的授课内容一、本门课程的授课内容讲授如下章节的内容讲授如下章节的内容绪论绪论绪论绪论第一章第一章第一章第一章 分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用第二章第二章第二章第二章 分子克隆载体分子克隆载体分子克隆载体分子克隆载体第三章第三章第三章第三章 核酸技术核酸技术核酸技术核酸技术第四章第四章第四章第四章 基因文库的构建基因文库的构建基因文库的构建基因文库的构建第五章第五章第五章第五章 基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定第六章第六章基因的表达技术基因的表达技术基因的表达技术基因的表达技术第七章第七章植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程第八章第八章动物基因工程动物基因工程动物基因工程动物基因工程第九章第九章第二代基因工程第二代基因工程第二代基因工程第二代基因工程第十章第十章第十章第十章 基因组学与生物信息技术基因组学与生物信息技术基因组学与生物信息技术基因组学与生物信息技术第一章第一章分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用l限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割lDNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化l核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割l核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成l核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接l核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰l其其它它酶酶类类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等第二章第二章 分子克隆载体分子克隆载体l分子克隆载体特点分子克隆载体特点l分子克隆载体种类分子克隆载体种类l细菌克隆载体细菌克隆载体:E.coli克隆载体(质粒型、噬菌体型、COS质粒型、噬粒型(phagemid)G-菌克隆载体;G+菌克隆载体;链霉菌克隆载体l酵母菌克隆载体酵母菌克隆载体l丝状真菌克隆载体丝状真菌克隆载体l植物克隆载体植物克隆载体l动物克隆载体动物克隆载体l克隆载体的选择克隆载体的选择l克隆载体的构建克隆载体的构建第三章第三章 核酸技术核酸技术l核酸分离纯化技术核酸分离纯化技术-DNA/供体、载体、片段，RNA/总RNA、mRNA、多聚核糖体RNAl核酸电泳技术核酸电泳技术(DNA和RNA)：常规电泳，脉冲场凝胶电泳，毛细管电泳lDNA限制酶切和限制酶图谱绘制技术限制酶切和限制酶图谱绘制技术lDNA分子的连接技术分子的连接技术lDNA聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR技术)l核酸杂交技术核酸杂交技术原位、斑点、Southern、Northern、Westernl核酸测序技术核酸测序技术化学法、酶法第四章第四章 基因文库的构建基因文库的构建l基因组文库的构建基因组文库的构建lcDNA文库的构建文库的构建第五章第五章 基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定l基因的分离与鉴定方法基因的分离与鉴定方法l真核基因分离实例真核基因分离实例l染色体染色体ARS的分离鉴定的分离鉴定l着丝粒着丝粒DNA的分高鉴定的分高鉴定l端粒的分离鉴定端粒的分离鉴定第六章第六章基因的表达技术基因的表达技术原核表达载体的构建原核表达载体的构建第七章第七章植物基因工程植物基因工程植物表达载体的构建，转化及表达产物检测植物表达载体的构建，转化及表达产物检测第八章第八章动物基因工程动物基因工程动物表达载体的构建，转化及表达产物检测动物表达载体的构建，转化及表达产物检测第九章第九章第二代基因工程第二代基因工程蛋白质工程基础蛋白质工程基础第十章第十章基因组学与生物信息技术基因组学与生物信息技术基因组研究进展，生物信息学的基本知识基因组研究进展，生物信息学的基本知识二、课程特点二、课程特点1.涉及学科多，适用面广涉及学科多，适用面广2.起点高、发展快，内容新颖起点高、发展快，内容新颖3.理论与实际联系密切理论与实际联系密切4.具有理学和工程学的特点具有理学和工程学的特点三、课程要求三、课程要求四、参考文献四、参考文献1.分子克隆操作指南(1982和1989年版,中英文版)2.DNACloning(Vol.1-4,1996)l3.基因工程，邱泽生，首都师范大学出版社，1992l4.基因工程原理（上下册），吴乃虎，科学出版社，2001l5.植物基因工程，王关林，方宏筠，科学出版社，1999l6.基因工程学原理，马建岗，西安交通大学出版社，20014.各种国外生物技术公司产品目录和定期出版物7.基因VIII，本杰明.卢因编著，余龙，赵寿元等译，科学出版社，20058.Internet相关网址五、考试五、考试l平时成绩：30%2.试卷成绩：70%，谢谢 谢！谢！