-沉默NET-1基因对肝癌细胞生物学行为的影响课件.ppt

沉默沉默NET-1NET-1基因基因对肝癌细胞生物学行为的影响对肝癌细胞生物学行为的影响v肝细胞肝癌（肝细胞肝癌（hepatocellularhepatocellular carcinoma HCC carcinoma HCC）是全球性是全球性的健康问题之一。我们南通启东是的健康问题之一。我们南通启东是WHOWHO确定的确定的HCCHCC高发研究高发研究现场。现场。v研究基于我们的首次发现研究基于我们的首次发现NET-1NET-1在在HCCHCC组织中特定表达，并组织中特定表达，并发现该基因参与发现该基因参与HCCHCC细胞的分裂增殖和癌发生、发展密切相细胞的分裂增殖和癌发生、发展密切相关的细胞运动过程关的细胞运动过程,探讨针对探讨针对NET-1NET-1的的siRNAsiRNA抑制肝癌癌细胞抑制肝癌癌细胞株株(SMMC-7721)(SMMC-7721)中中NET-1NET-1基因的表达，及该基因对癌细胞增基因的表达，及该基因对癌细胞增殖、迁移、内吞的影响。殖、迁移、内吞的影响。一、项目研究背景一、项目研究背景NET-1NET-1与与NET-2NET-2到到NET-7NET-7一起统称为一起统称为NET-XNET-X，它们是由，它们是由SerruSerru等于等于20002000年在年在EST EST 数据库中发现的数据库中发现的7 7 个新的含个新的含4 4 次跨膜蛋白超家次跨膜蛋白超家族族(transmembrane 4 superfamily(transmembrane 4 superfamily 或或tetraspan family,tetraspan family,简称简称TM4SF)TM4SF)的成员。的成员。NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1)定位于染色体定位于染色体1 1p34.1p34.1上，其上，其mRNAmRNA全长为全长为12971297bp(bp(基因库登记号基因库登记号码码AF065388)AF065388)，为为TM4SFTM4SF的成员之一，的成员之一，最近证实其为肿瘤相关基因。最近证实其为肿瘤相关基因。1、NET-1siRNA表达质粒和表达质粒和myc-NET-1重组表达质粒的重组表达质粒的构建构建。2、细胞培养与转染。、细胞培养与转染。3、细胞内总、细胞内总RNA抽提及抽提及RT-QPCR检测检测NET-1m RNA。4、Western blot检测检测NET-1蛋白表达。蛋白表达。5、CCK-8法检测细胞增殖活性。法检测细胞增殖活性。6、流式细胞仪、流式细胞仪(FCN)检测各组细胞处于不同细胞周期检测各组细胞处于不同细胞周期中的比例与增殖指数。中的比例与增殖指数。7、细胞划痕试验检测细胞二围空间的迁移能力。、细胞划痕试验检测细胞二围空间的迁移能力。8、Transwell小室检测细胞三围空间的迁移能力。小室检测细胞三围空间的迁移能力。9、Capture-ELISA方法测量细胞内生物素标记的转铁方法测量细胞内生物素标记的转铁蛋白水平。蛋白水平。10、anti-uPAR标记的癌细胞伪足形成实验。标记的癌细胞伪足形成实验。一、一、材料与方法材料与方法转染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721细胞中NET-1mRNA的表达（RT-QPCR）以未处理组为1。NET-1-siRNA组和myc-NET-1组分别与未处理组相比(P0.05，p0.01)；NET-1-siRNA组与pU6H1-GFP组相比(P0.05，p0.01)；myc-NET-1组与pcDNA3.1/myc组相比(P0.05，p0.01)2 2、RT-QPCRRT-QPCR检测转染检测转染NET-1siRNANET-1siRNA和和myc-NET-1myc-NET-1细胞中细胞中NET-1 NET-1 mRNAmRNA的结果的结果 3.NET-1蛋白表达在蛋白表达在HCC组织中显著高于癌旁组组织中显著高于癌旁组织中。织中。-actinNET-1Lanes 1,3,5,7 cancerous tissues;Lanes2,4,6,8:adjacent noncancerous tissues（1）随时间的延长）随时间的延长NET-1-siRNA处理组细胞增殖明显减少；处理组细胞增殖明显减少；NET-1稳稳定表达组细胞增殖明显增多。定表达组细胞增殖明显增多。4.干扰干扰NET-1 可以抑制可以抑制HCC细胞增殖细胞增殖5.干扰干扰NET-1 可以抑制可以抑制HCC细胞迁移细胞迁移在在NET-1siRNA组中组中显著减少显著减少(p0.05)，在在myc-NET-1组中明组中明显增加显增加(p0.05）NET-1 siRNA处理细处理细胞后迁移能力明显下胞后迁移能力明显下降。降。转染转染48h后穿过后穿过Matrigel胶细胞数胶细胞数NET-1 siRNA组组（21.425.74）和）和pU6H1-GFP（45.608.25）差异有显著）差异有显著统计学意义（统计学意义（P0.05）；）；myc-NET-1组（组（64.806.14）和）和pcDNA3.1/myc（38.207.22）差异有显著统计学意义）差异有显著统计学意义（P0.05）。）。7.干扰干扰NET-1 可以抑制可以抑制HCC细胞侵袭伪足形成细胞侵袭伪足形成NET-1siRNANET-1siRNA处理细胞伪处理细胞伪足形成细胞百分比明显足形成细胞百分比明显减少减少(p0.01)p0.01)NET-1siRNANET-1siRNA处理处理细胞中以细胞中以anti-anti-uPARuPAR标记的癌细标记的癌细胞伪足明显减少胞伪足明显减少。9.NET-1表达与表达与HCC临床病理因素和预后的研究临床病理因素和预后的研究(1)(1)NET-1NET-1表达与表达与HCCHCC临床病理因素临床病理因素密切相关。密切相关。NET-1NET-1基因蛋白表达与基因蛋白表达与HCCHCC临床病理因素的关系临床病理因素的关系(76(76例例)（2）Kaplan-Meier生存曲线生存曲线（3）Cox比例风险模型多因素生存分析比例风险模型多因素生存分析HCCHCC转移、组织学分级，癌中转移、组织学分级，癌中NET-1NET-1、JAB1JAB1、p-p27T187p-p27T187、p-p27S10p-p27S10、PCNAPCNA表达均具有独表达均具有独立的预后意义。立的预后意义。风险分析提示这些因素增强时均能增加风险分析提示这些因素增强时均能增加HCCHCC病人的死亡风险病人的死亡风险(其风险比均其风险比均1)1)1 1.首次发现首次发现NET-1NET-1在肝脏良恶性组织中表达的特点。在肝脏良恶性组织中表达的特点。2 2.在在HCCHCC细胞中干扰细胞中干扰NET-1NET-1表达，抑制癌细胞的表达，抑制癌细胞的迁移、迁移、侵袭、内吞和伪足形成的能力，并能抑制裸侵袭、内吞和伪足形成的能力，并能抑制裸鼠鼠HCC 生长。提示生长。提示NET-1NET-1可能在可能在HCCHCC细胞运动中发细胞运动中发挥作用，挥作用，是是HCCHCC细胞增殖相关蛋白。细胞增殖相关蛋白。3.NET-1表达与表达与HCC临床病理因素密切相关，是显著影临床病理因素密切相关，是显著影响患者预后的独立指标，高表达患者死亡风险增加，具响患者预后的独立指标，高表达患者死亡风险增加，具有显著的临床预后评估价值。有显著的临床预后评估价值。4.已研制的已研制的NET-1多克隆抗体，可用于免疫组化、蛋白多克隆抗体，可用于免疫组化、蛋白 印迹等多种实验，具有临床推广使用的可行性与价值。印迹等多种实验，具有临床推广使用的可行性与价值。四、项目研究创新点四、项目研究创新点 致致 谢谢1、该课题研究历时、该课题研究历时9年先后得到了江苏省教育厅高新技术年先后得到了江苏省教育厅高新技术课题和南通市社会发展课题课题和南通市社会发展课题 的经费资助。的经费资助。2、NET-1抗体的合成得到了美国旧金山基因生物技术公司抗体的合成得到了美国旧金山基因生物技术公司的协助。的协助。3、课题完成共培养硕士学位毕业研究生课题完成共培养硕士学位毕业研究生12位。他们为该位。他们为该课题中做了大量的工作，付出了辛勤的汗水，奉献了卓越课题中做了大量的工作，付出了辛勤的汗水，奉献了卓越的智慧。的智慧。Thank you！