环境生物监测与安全性评价课件.ppt

第一节第一节 环境监测环境监测一、概念一、概念环境监测的过程一般为：环境监测的过程一般为：现场调查现场调查 监测计划设计监测计划设计 优化布点优化布点 样品采集样品采集 运送保存运送保存 分析测试分析测试 数据处理数据处理 综合评价综合评价 二、环境监测的目的和分类二、环境监测的目的和分类（一）环境监测的目的一）环境监测的目的 环境监测的目的是准确、及时、全面地环境监测的目的是准确、及时、全面地反映环境质量现状及发展趋势，为环境管理、反映环境质量现状及发展趋势，为环境管理、污染源控制、环境规划等提供科学依据。污染源控制、环境规划等提供科学依据。（二）环境监测的分类（二）环境监测的分类 1.1.按监测目的分类按监测目的分类（1 1）监视性监测（又称为例行监测或常规监测）监视性监测（又称为例行监测或常规监测）对指定的有关项目进行定期的、长时间的监对指定的有关项目进行定期的、长时间的监测，以确定环境质量及污染源状况、评价控制措测，以确定环境质量及污染源状况、评价控制措施的效果，衡量环境标准实施情况和环境保护工施的效果，衡量环境标准实施情况和环境保护工作的进展。作的进展。包括对污染源的监督监测和环境质量监测。包括对污染源的监督监测和环境质量监测。（2 2）特定目的监测（又称为特例监测）特定目的监测（又称为特例监测和应急监测）和应急监测）根据特定的目的可分为以下四种：根据特定的目的可分为以下四种：A A 污染事故监测污染事故监测 B B 仲裁监测仲裁监测 C C 考核验证监测考核验证监测 D D 咨询服务监测咨询服务监测（3 3）研究性监测（又称科研监测）研究性监测（又称科研监测）研究性监测是针对特定目的科学研究而进研究性监测是针对特定目的科学研究而进行的高层次的监测。例如环境本底底监测及研究；行的高层次的监测。例如环境本底底监测及研究；有毒有害物质对从业人员底影响研究；为监测工有毒有害物质对从业人员底影响研究；为监测工作本身服务的科研工作的监测，如统一方法、标作本身服务的科研工作的监测，如统一方法、标准分析方法的研究、标准物质的研制等。这类研准分析方法的研究、标准物质的研制等。这类研究往往要求多学科合作进行。究往往要求多学科合作进行。2.2.按监测介质对象分类按监测介质对象分类 可分为水质监测、空气监测、土壤监测、可分为水质监测、空气监测、土壤监测、固体废物监测、生物监测、噪声和振动监测、固体废物监测、生物监测、噪声和振动监测、电磁辐射监测、放射性监测、热监测、光监测、电磁辐射监测、放射性监测、热监测、光监测、卫生（病源体、病毒、寄生虫等）监测等。卫生（病源体、病毒、寄生虫等）监测等。三、环境监测特点三、环境监测特点（一）环境监测的发展一）环境监测的发展 污染监测阶段或被动监测阶段污染监测阶段或被动监测阶段 环境监测阶段或主动监测阶段环境监测阶段或主动监测阶段 污染防治监测阶段或自动监测阶段污染防治监测阶段或自动监测阶段（二）二）环境监测的特点环境监测的特点1.1.环境监测的综合性环境监测的综合性环境监测的综合主要表现在监测手段、环境监测的综合主要表现在监测手段、监测对象的多样性以及监测数据处理监测对象的多样性以及监测数据处理 的复杂性。的复杂性。2.2.环境监测的连续性环境监测的连续性3.3.环境监测的追踪性环境监测的追踪性四、监测技术概述四、监测技术概述 监测技术包括采样技术、测试技术和数据处理技术，监测技术包括采样技术、测试技术和数据处理技术，这里以污染物的测试技术为重点作以概述。这里以污染物的测试技术为重点作以概述。（一）化学、物理技术（一）化学、物理技术 重量法常用作残渣、降尘、硫酸盐、油类等的测定；重量法常用作残渣、降尘、硫酸盐、油类等的测定；容量分析被广泛用于水中酸度、碱度、化学需氧量、容量分析被广泛用于水中酸度、碱度、化学需氧量、溶解氧、硫化物、氰化物的测定；溶解氧、硫化物、氰化物的测定；仪器分析方法被广泛用于对环境中污染物进行定性仪器分析方法被广泛用于对环境中污染物进行定性和定量的测定。和定量的测定。（二）生物技术二）生物技术 这是利用生物在污染环境中所产生的各种反映信这是利用生物在污染环境中所产生的各种反映信息来判断环境质量的方法，是一种最直接也是一种综息来判断环境质量的方法，是一种最直接也是一种综合的方法。合的方法。生物监测包括生物体内污染物含量的测定；观察生物生物监测包括生物体内污染物含量的测定；观察生物在环境中受伤害症状；生物的生理生化反应；生物群在环境中受伤害症状；生物的生理生化反应；生物群落结构和种类变化等手段来判断环境质量。落结构和种类变化等手段来判断环境质量。第二节第二节 生物传感器生物传感器一、概述一、概述 传统的环境监测方法通常采用离线分析方法，其传统的环境监测方法通常采用离线分析方法，其缺缺点点是：分析速度慢，操作复杂，且需要昂贵仪器，不适是：分析速度慢，操作复杂，且需要昂贵仪器，不适宜进行现场快速监测和连续在线分析。建立和发展连续、宜进行现场快速监测和连续在线分析。建立和发展连续、在线、快速的现场监测体系尤其重要。在线、快速的现场监测体系尤其重要。生物传感器实际上是一类特殊的化学传感器生物传感器实际上是一类特殊的化学传感器。国际。国际纯粹和应用化学联合会对纯粹和应用化学联合会对化学传感器化学传感器的定义为：一种小的定义为：一种小型化的、能专一和可逆地对某种化合物或某种离子具有型化的、能专一和可逆地对某种化合物或某种离子具有应答反应，并能产生一个与此化合物或此离子浓度成比应答反应，并能产生一个与此化合物或此离子浓度成比例地分析信号的传感器。例地分析信号的传感器。生物传感器是一种将生物感应元件的专一生物传感器是一种将生物感应元件的专一性与一个能够产生与待测物浓度成比例的信号性与一个能够产生与待测物浓度成比例的信号传导器结合起来的一种分析装置。传导器结合起来的一种分析装置。最先问世的生物传感器是酶电极。最先问世的生物传感器是酶电极。2020世纪世纪7070年代后，人们开始研究微生物电极、细胞器年代后，人们开始研究微生物电极、细胞器电极、动植物组织电极以及免疫电极等新型生电极、动植物组织电极以及免疫电极等新型生物传感器，使生物传感器的类型大大增多。物传感器，使生物传感器的类型大大增多。二、生物传感器的基本组成和工作原理二、生物传感器的基本组成和工作原理生物传感器由生物传感器由敏感元件敏感元件，即，即生物元件和信号传导器生物元件和信号传导器组成。组成。生物元件：生物元件：是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等。传导器：传导器：主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，当待测物与分子识别元件特异性结合后,所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等,从而达到分析检测的目的。生物传感器的基本原理如下图所示：生物传感器的基本原理如下图所示：生物传感器的工作原理主要决定于敏感生物传感器的工作原理主要决定于敏感元件（分子识别单元）和待测物质之间的相互元件（分子识别单元）和待测物质之间的相互作用，有以下几种类型：作用，有以下几种类型：（1 1）将化学信号转化为电信号）将化学信号转化为电信号 已研究的大部分生物传感器的工作原理均属于这种已研究的大部分生物传感器的工作原理均属于这种类型。类型。（2 2）将热变化转化为电信号）将热变化转化为电信号（3 3）将光效应转化为电信号）将光效应转化为电信号（4 4）直接产生电信号方式）直接产生电信号方式三、生物传感器的分类三、生物传感器的分类一般可从以下三个角度进行分类：一般可从以下三个角度进行分类：1.根据传感器输出信号的产生方式根据传感器输出信号的产生方式（1）生物亲和型生物传感器）生物亲和型生物传感器S+RSR底物底物受体受体（2）代谢型或催化型生物传感器代谢型或催化型生物传感器S+RSRP底物底物受体受体生成物生成物2.2.根据生物传感器中分子识别元件上的敏感物质根据生物传感器中分子识别元件上的敏感物质可分为：酶传感器、微生物传感器、组织传感可分为：酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞传感器、免疫传感器等。器、细胞传感器、免疫传感器等。3.3.根据生物传感器的信号转化器根据生物传感器的信号转化器可分为：电化学生物传感器、半导体生物传感器、可分为：电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等生物传感器等四、生物传感器的特点四、生物传感器的特点1.根据生物反应的特异性和多样性,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器,因而测定范围广泛测定范围广泛。2.测定时一般不需要样品预处理，也不需加入其他试剂不需要样品预处理，也不需加入其他试剂。3.由于它的体积小，可以实现连续在线监测连续在线监测。4.响应快，样品用量少样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用反复多次使用。5.传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，因而便于推广普及便于推广普及。1.酶传感器酶传感器它将活性物质酶覆盖在电极表面它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或酶与被测的有机物或无机物反应无机物反应,形成一种能被电极响应的物质。形成一种能被电极响应的物质。例如例如,脲在尿素酶催化下发生反应脲在尿素酶催化下发生反应1967年年Updick和和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极；此后做成了第一支葡萄糖电极；此后,这类酶传这类酶传感器通常是通过检测产物感器通常是通过检测产物H2O2的浓度变化或氧的消耗的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。量来检测底物。五、生物传感器在环境监测中的应用五、生物传感器在环境监测中的应用葡萄糖电极葡萄糖电极缺点缺点:(1)(1)溶解氧的变化可能引起电极响应的波动溶解氧的变化可能引起电极响应的波动;(2)(2)由于氧的溶解度有限由于氧的溶解度有限,当溶解氧贫乏时当溶解氧贫乏时,响应电流明显响应电流明显下降而影响检测限下降而影响检测限;(3)(3)传感器响应性能受溶液传感器响应性能受溶液pHpH值和温度影响较大值和温度影响较大2.2.微生物传感器微生物传感器微生物传感器分为两类：微生物传感器分为两类：一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。好氧微生物在繁殖时需消耗大量的氧好氧微生物在繁殖时需消耗大量的氧,可以氧浓度的变可以氧浓度的变化来观察微生物与底物的反应情况。化来观察微生物与底物的反应情况。装置装置是：由适合的微生物电极与氧电极组成。是：由适合的微生物电极与氧电极组成。原理原理是：利用微生物的同化作用耗氧是：利用微生物的同化作用耗氧,通过测量氧电极通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量电流的变化量来测量氧气的减少量,从而达到测量底物从而达到测量底物浓度的目的浓度的目的.例如例如,荧光假单胞菌荧光假单胞菌,能同化葡萄糖；芸苔丝孢能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇酵母可同化乙醇,因此可分别用来制备葡萄糖因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时,均均消耗溶液中的氧消耗溶液中的氧,因此可用氧电极来测定因此可用氧电极来测定基于不同类型的信号转换器基于不同类型的信号转换器,常见的微生物传常见的微生物传感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频阻抗型和燃料电池型，高频阻抗型和燃料电池型，3.BOD生物传感器生物传感器利用利用生物传感器的原理生物传感器的原理，以微生物的单一菌种或混，以微生物的单一菌种或混合种群作为合种群作为BOD微生物电极，由于水体中微生物电极，由于水体中BOD物质的加物质的加人或降解代谢的发生，导致水中的微生物内外源呼吸方人或降解代谢的发生，导致水中的微生物内外源呼吸方式的变化或转化，藕联着电流强弱信号的改变，一定条式的变化或转化，藕联着电流强弱信号的改变，一定条件下传感器输出的电流值与件下传感器输出的电流值与BOD的浓度呈线性关系。用的浓度呈线性关系。用于制作于制作BOD生物传感器的微生物主要有用生物传感器的微生物主要有用单一菌种如单一菌种如丝丝孢酵母、梭菌、芽孢杆菌及孢酵母、梭菌、芽孢杆菌及混合微生物种群如活性污泥混合微生物种群如活性污泥制成的制成的BOD传感器，还有用生物发光菌和嗜热菌的。传感器，还有用生物发光菌和嗜热菌的。基本组成：基本组成：存在问题：存在问题：由于微生物培养不稳定，使传感器不能保持良好、稳定由于微生物培养不稳定，使传感器不能保持良好、稳定的运行；的运行；一种微生物不可能对各种废水中所有的有机物都产生响一种微生物不可能对各种废水中所有的有机物都产生响应，因此，用单一菌种制备的应，因此，用单一菌种制备的BOD传感器只适用于部分传感器只适用于部分类型的废水；类型的废水；微生物细胞在测定废水中有毒物质时由于缺乏抗性，会微生物细胞在测定废水中有毒物质时由于缺乏抗性，会出现出现“中毒中毒”现象；现象；用常温微生物组成的用常温微生物组成的BOD微生物电极的使用寿命不长。微生物电极的使用寿命不长。4.4.免疫传感器免疫传感器抗体对相应的抗原具有抗体对相应的抗原具有识别和结合识别和结合的双重功能的双重功能,在与在与抗原结合时抗原结合时,选择性强选择性强,灵敏度高，免疫传感器就是利用灵敏度高，免疫传感器就是利用其双重功能将抗体或抗原和换能器组合而成的装置。其双重功能将抗体或抗原和换能器组合而成的装置。由于蛋白质分子由于蛋白质分子(抗体或抗原抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基携带有大量电荷、发色基团等团等,当抗原抗体结合时当抗原抗体结合时,会产生电学、化学、光学等变会产生电学、化学、光学等变化化,通过适当的传感器可检测这些参数通过适当的传感器可检测这些参数,从而构成不同的从而构成不同的免疫传感器，总的来说可分为两类免疫传感器，总的来说可分为两类:(1)非标记型非标记型;(2)标记型标记型图图10106 6免疫传感器的原理免疫传感器的原理如黄曲霉毒素传感器如黄曲霉毒素传感器,它它由氧电极和黄曲霉毒素由氧电极和黄曲霉毒素抗体膜组成抗体膜组成,加到待测样加到待测样品中品中,酶标记的及未标记酶标记的及未标记的黄曲霉毒素便会与膜的黄曲霉毒素便会与膜上的黄曲霉毒素抗体发上的黄曲霉毒素抗体发生竞争反应生竞争反应,测定酶标黄测定酶标黄曲霉毒素与抗体的结合曲霉毒素与抗体的结合率率,便可知样品中的含量。便可知样品中的含量。根据使用的信号转换器,有电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器等。免疫传感器在环境检测中的应用：免疫传感器在环境检测中的应用：检测农药：对于有机农药传感器检测不仅比色谱法检测更方便，而且检测精度也是分光光度法很难达到的。Li等 制备出五氯酚(PCP)的两种抗原，获得PCP-BSA耦联物并免疫接种得到相应抗体，设计出一种快速经济的免疫检测法，能够在5mln之内检测出土壤样品中的PCP含量，检测限为1mgL。还有除草剂草甘磷、谷连松等。检测有机物：Gauger等 开发出一种可携带式的现场检测连续流动免疫传感器，预处理简单，能在5min之内测定土壤中的三硝基甲苯和环三亚甲基三硝胺，精确度可达到10gL。检测金属类物质：主要是重金属离子cr(VI)，Pb(II)，Cu(II)，Cd(II)，Cr(III)，Hg(II)，Ag(II)，Co(II)，Sn(II)和Ni(II)等。Blake等 将乙二胺四乙酸、二亚乙醛三胺五乙酸(DTPA)等与重金属离子Cd(II)，Co(II)，Pb(II)和U(VI)螯合后作半抗原制成单克隆抗体，利用竞争机制，制成免疫传感器荧光检测。检测微生物：Wong等 开发出一种基于石英晶体微量天平(QCM)技术的免疫传感器检测沙门氏菌。在细胞数量线性范围10 510 8ml内，该传感器检测沙门氏菌没有明显干扰，检测下限为10 4ml。还可检测金黄色葡萄球菌和其他一些病毒和细菌。存在的问题：存在的问题：目前存在的问题在于，已得到的有害物质对应的抗体有限，固定后的抗体的稳定性也是免疫传感器发展的制约因素之一；传感器在测定后再生困难，需要重新固定分子识别膜等条件都给免疫传感器技术从实验室技术转化为商业化产品带来了困难。但是随着新的微型换能器的应用、具有良好稳定性的新抗体的开发及固定抗体的稳定剂的研制，免疫传感器在检测环境中痕量有害物质和堆肥化过程控制中的应用必将有更加广阔的前景。5.DNA生物传感器生物传感器 分子生物学与生物技术的进展为研究以核酸探针为敏感元件的DNA生物传感器提供了可能。与酶和抗体不同，核酸识别层十分稳定，并且易于合成或再生以供重复使用。DNA生物传感器是将核酸作为分子识别及检测层并与各种物理的、化学的换能器相结合而产生的一种可以在物质分子水平上进行快速检测、监控的微量分析技术。DNA生物传感器在稳定性、可重复性、快速性、便捷性、灵敏度等方面所表现出的优越性，使得它成为当今生物分析测量领域的热点。（1 1）核酸杂交生物传感器的原理）核酸杂交生物传感器的原理DNA生物传感器生物传感器依据依据DNA分子之间或分子之间或DNA分子与其它物质分子与其它物质的相互作用的相互作用(也称杂化也称杂化作用作用)所引起的各种变所引起的各种变化，来记录、分析发化，来记录、分析发生在传感器和探测目生在传感器和探测目标之间的杂化反应，标之间的杂化反应，以完成对目标物的探以完成对目标物的探测和监控。测和监控。用非螺旋的肽骨架替代用非螺旋的肽骨架替代DNA分子中的磷酸骨分子中的磷酸骨架合成出架合成出肽核酸肽核酸(PNA)，他们合成的，他们合成的PNA中，中，含有与胸腺嘧啶相连的含有与胸腺嘧啶相连的氨基单位，保留了氨基单位，保留了DNA分子的基本分子的基本杂化特征，同样可以识杂化特征，同样可以识别双株别双株DNA链中的互补链中的互补物。物。（2 2）污染物的检测）污染物的检测 DNA传感器除可用于受感染微生物的核酸序列分析；检测污染物和其它环境有害物质：Pandey 等人将双链DNA固化在柱面波导的表面形成DNA 生物传感器，并结合流式注射系统，以测量荧光信号的强度来检测可与双链DNA发生嵌入反应的化合物；检测DNA的物理损伤；可用于研究污染物与DNA之间的相互作用，为解释污染物毒性作用机理提供了可能。6.6.其他生物传感器其他生物传感器6.1 6.1 酚类微生物传感器酚类微生物传感器属于酶传感器。用酶电极安培传感器检测酚类化合物时，电极表面的酶分子被氧和过氧化氢氧化，接着被酚类化合物重新还原，酚类主要转化为苯醌或酚自由基，这些产物通常具有电化学活性，能在相对于饱和甘汞电极（SCE)0V以下的电位还原，还原电流与溶液中酚类化合物的浓度成正比。6.2阴离子表面活性剂传感器阴离子表面活性剂传感器 包括能降解烷基苯磺酸（LAS)的细菌和一个氧电极。当阴离子表面活性剂存在时，细菌的呼吸作用增加，导致溶解氧变化。6.3水体富营养化监测传感器水体富营养化监测传感器 引起水体富营养化的蓝细菌细胞体内有藻青素，它显示的荧光光谱不同于其他的微生物，从而用对荧光敏感的生物传感器就能监测蓝细菌的浓度。6.4生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮6.5检测有毒有害物质的生物传感器检测有毒有害物质的生物传感器6.6空气和废气监测传感器空气和废气监测传感器（1）CO2传感器传感器（2）亚硫酸盐传感器）亚硫酸盐传感器（3）甲烷传感器）甲烷传感器第三节第三节PCR技术技术PCR的概念的概念PCR反应原理反应原理PCR反应体系和方法反应体系和方法PCR反应特点反应特点PCR类型类型PCR技术在环境检测中的应用技术在环境检测中的应用一、一、PCR的概念的概念PCR概念的提出：概念的提出：1983，KaryMullis定义：定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内，是通过模拟体内DNA复制的方式，复制的方式，在体外选择性地将在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的某个特殊区域扩增出来的技术。技术。引物引物引物引物Mullis的的构思构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶I的的Klenow片段。不耐高温。片段。不耐高温。1988年年Saiki等从温泉（等从温泉（Hotspring）中分离的一株）中分离的一株水生嗜热杆菌水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。聚合酶。thermus aquaticus此酶具有以下特点此酶具有以下特点：耐高温，耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度增长度(2.0Kb)。酶命名为酶命名为TaqDNA多聚酶多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此。此酶的发现使被酶的发现使被PCR广泛应用。广泛应用。在在1989年，年，Science将将PCR中的中的TaqDNA多聚酶命多聚酶命名为当年的风云分子名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)在微量离心管中在微量离心管中,加入适量的加入适量的缓冲液缓冲液,微量的微量的模板模板DNA,四种脱氧单核苷酸四种脱氧单核苷酸,耐热性耐热性多聚酶多聚酶,一对合成一对合成DNA的的引物引物,通过通过高温变性、低温退火高温变性、低温退火和和中温延伸中温延伸三个阶段为三个阶段为一个循环的反应过程一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍数放大一倍,一般样品是经过一般样品是经过30次循环次循环,最终最终使基因放大使基因放大了数百万倍了数百万倍;扩增了特异区段的扩增了特异区段的DNA带。带。二、二、PCR技术的基本原理技术的基本原理 体内体内DNADNA的复制的复制DNADNA聚合酶聚合酶 dNTPdNTPdNTPdNTP解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类引物引物5 5 33加热加热变变性性复复性性复温DNA的变性和复性的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火三、三、PCR的反应体系和方法的反应体系和方法PCR管管加加热热使使模模板板变变性性,退退火火使使引引物物与与模模板板DNA互互补补,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温(72),在在Tap多多聚聚酶酶的的作作用用下下,以以dNTP为为原原料料,以以引引物物为为复复制制的起点的起点,合成新链。合成新链。如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度,即即高高温温变变性性、低低温温退退火火和和中中温温延延伸伸三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍,一一般般样样品品是是经经过过30次次循循环环,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍;将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能能见见到到扩增特异区段的扩增特异区段的DNA带。带。总体积总体积50-100 lBuffer缓冲液缓冲液dNTP原料原料Primer引物引物DNA分子分子模板模板Taq酶酶DNA聚合酶聚合酶1 1 反应体系反应体系PCR技术的基本过程(1)模板模板模板模板DNADNAdNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNADNAdNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶9494oC52 基本过程PCR技术的基本过程(2)TaqTaq酶酶酶酶模板模板模板模板DNADNAdNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer循循环环仪仪949455557272TaqTaq酶酶酶酶模板模板模板模板DNADNAdNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer7257257min7min琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)1 1）PCRPCR反应成分反应成分（1 1）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 L L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3 PCR3 PCR反应条件反应条件（2 2）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3 3）TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。（4 4）dNTPdNTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度；浓度取决于扩增片段的长度；四种四种dNTPdNTP浓度应相等；浓度应相等；浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反浓度过低则降低反 应产量；应产量；dNTPdNTP可与可与MgMg2+2+结合结合,使游离的使游离的MgMg2+2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA 聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5 5）Mg2+Mg2+Mg Mg2+2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。MgMg2+2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；MgMg2+2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。MgMg2+2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等等的浓度影响反应中游离的的浓度影响反应中游离的MgMg2+2+浓度。浓度。2）循环参数）循环参数(1)变性变性使双链使双链DNA解链为单链，解链为单链，94oC20-30秒秒(2)退火退火温度由引物长度和温度由引物长度和GC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温降低温度可增加反应的灵敏性。度可增加反应的灵敏性。（3）延伸）延伸70-75,一般为一般为72，延伸时间由扩增片段长度决定，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数）循环次数主要取决于模版主要取决于模版DNA的浓度，的浓度，一般为一般为25-35次，次数次，次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加过多：扩增效率降低错误掺入率增加经典循环参数（500bp以内）9430s9430s5545s5545s72721min1min945min945min30次727min727min42forever42forever四、四、PCR反应的特点反应的特点1 1）高度的灵敏性）高度的灵敏性3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计：引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。与非扩增区无同源序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 15-40 bpbp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占50-60%50-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物3端为关键碱基；55端端无严格限制。无严格限制。3 3）操作简便易行）操作简便易行PCR扩增法扩增法,只需要数小时只需要数小时,就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出1g基因组基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。通通常常的的DNA扩扩增增法法是是分分子子克克隆隆法法,首首先先要要构构建建含含有有目目的的的的基基因因的的载载体体,然然后后将将它它导导入入细细胞胞后后进进行行扩扩增增,还还要要用用同同位位索索探探针针进进行行筛筛选选;这这种种方方法法,要要经经过过DNA内内切切、连连接接、转化和培养等相关的过程转化和培养等相关的过程,操作复杂操作复杂,一般需要数周时间。一般需要数周时间。目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取提取提取DNADNA分子分子分子分子1）不对称）不对称PCR目的：目的：扩增产生特异长度的单链扩增产生特异长度的单链DNA。方法：方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.01 0.5M,关键关键是限制性引物的绝对量。是限制性引物的绝对量。用途：用途：制备核酸序列测定的模板制备核酸序列测定的模板制备杂交探针制备杂交探针五、五、PCR的类型的类型 高浓度引物低浓度引物2)反向反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNADNADNA片段对片段对片段对片段对某个已知某个已知某个已知某个已知DNADNADNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。可可可可对对对对未未知知序序列列扩扩扩扩增增增增后后后后进进进进行行行行分分分分析析析析,如如如如探探探探索索索索邻邻邻邻接接接接已已已已知知知知DNADNADNADNA片片片片段段段段的的的的序序序序列列列列；用用用用于于于于仅仅仅仅知知知知部部部部分分分分序序序序列列列列的的的的全全全全长长长长cDNAcDNAcDNAcDNA的的的的克克克克隆隆隆隆,扩扩扩扩增增增增基因文库的插入基因文库的插入基因文库的插入基因文库的插入DNADNADNADNA；建立基因组步移文库。建立基因组步移文库。建立基因组步移文库。建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列电电电电泳泳泳泳引物引物123412343 3）多重）多重PCRPCR（复合（复合PCRPCR）设计多对引物，在同一个设计多对引物，在同一个PCRPCR反应体系中，同时扩增一份反应体系中，同时扩增一份DNADNA样本中几个样本中几个不同靶区域的不同靶区域的DNADNA片断，这一过程称之为多重片断，这一过程称之为多重PCRPCR。用于检测特定基因序列的用于检测特定基因序列的存在或缺失。存在或缺失。4）标记）标记PCR（LP-PCRLabelledprimers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直用以直观地检测目的基因。观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物5 5）原位）原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still In Still PCR,IsPCR,IsPCRPCR）是由是由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是利用年首创。它是利用完整的细胞作为完整的细胞作为一个微小的反应体系一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段来扩增细胞内的目的片段,在不破在不破坏细胞的前提下坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。6）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增六、六、PCR技术在环境检测中的应用技术在环境检测中的应用应用应用PCR技术研究特定环境中微生物区系的组成、结技术研究特定环境中微生物区系的组成、结构，分析种群动态。构，分析种群动态。应用应用PCR技术监测环境中的特定微生物，如致病菌和技术监测环境中的特定微生物，如致病菌和工程菌。工程菌。从环境样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA；以从环境微生物中提取的DNA或RNA核酸作为模板，进行PCR扩增反应；PCR反应产物的检测与分析第四节第四节DNA分子标记技术分子标记技术一、分子标记的概念一、分子标记的概念分子标记分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的是指可遗传的并可检测的DNA序列。序列。能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组片段，它直接反映基因组DNA间的差异。间的差异。二、分子标记的种类二、分子标记的种类分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。类。第一类是以第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术分子杂交为核心的分子标记技术，包括：限，包括：限制性片段长度多态性标记（制性片段长度多态性标记（RFLP标记）；标记）；DNA指纹技指纹技术术；原位杂交等；原位杂交等；第二类是第二类是以以PCR技术为核心的分子标记技术技术为核心的分子标记技术，包括：随，包括：随机扩增多态性机扩增多态性DNA标记（标记（RAPD标记）；简单序列重复标记）；简单序列重复标记（标记（SSR标记）；扩增片段长度多态性标记（标记）；扩增片段长度多态性标记（AFLP标标记）等；记）等；第三类是第三类是一些新型的分子标记一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性，如：单核苷酸多态性（SNP标记）；表达序列标签（标记）；表达序列标签（EST标记）等。标记）等。三、分子标记技术在环境监测中的应用三、分子标记技术在环境监测中的应用1.分析环境污染物的遗传毒性效应，为污染物分析环境污染物的遗传毒性效应，为污染物早期诊断和评价提供依据；早期诊断和评价提供依据；2.环境致病微生物的检测。环境致病微生物的检测。3.利用利用RTPCR技术检测禽流感病毒，技术检测禽流感病毒，SARS病毒等。病毒等。第五节第五节分子生物学在环境微生物研分子生物学在环境微生物研究中的应用究中的应用重组细菌用于环境污染防治重组细菌用于环境污染防治分子生物学技术在环境微生物监测中的应用分子生物学技术在环境微生物监测中的应用分子生物技术在环境基因工程菌的稳定性和分子生物技术在环境基因工程菌的稳定性和安全性研究中的应用安全性研究中的应用5.1重组细