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分离分析新技术在天然药物研究中的应用 马建苹马建苹Tel:0931-2976699(O)E-mail: u超临界流体萃取技术一.基本原理1 1.超临界流体的特性超临界流体的特性 相态相态性质性质 气体气体 超临界流体超临界流体 液体液体密度密度(kg/m(kg/m3 3)1.0 7.0)1.0 7.0 10102 2 1.01.0 10103 3黏度黏度(Pa(Pas s)10)10-6-61010-5-5 10 10-5 -5 1010-4-4扩散系数扩散系数(mm2 2/s/s)10)10-5 -5 1010-7-7 10 10-9-9(1)(1)被提取物的性质被提取物的性质(2)(2)压力的影响压力的影响(3)(3)温度的影响温度的影响(4)(4)夹带剂的影响夹带剂的影响2 2.超临界超临界COCO2 2流体的溶解性能流体的溶解性能3 3.超临界超临界COCO2 2流体萃取的优势流体萃取的优势(1)(1)防止热敏性物质可能产生的氧化和分解防止热敏性物质可能产生的氧化和分解,保持各组分的原有特性。保持各组分的原有特性。(2)(2)无溶剂残留问题。无溶剂残留问题。(3)(3)实现选择性提取。实现选择性提取。(4)(4)提取较完全。提取较完全。(5)(5)仪器联用仪器联用,实现高效、快速、准确分析。实现高效、快速、准确分析。(6)CO(6)CO2 2超临界流体适合于工业化生产。超临界流体适合于工业化生产。萃取釜萃取釜减压阀减压阀分离釜分离釜加压泵加压泵4 4.超临界超临界COCO2 2流体萃取设备简介流体萃取设备简介蜂胶的SFE纯化流程(1)(1)萃取压力萃取压力(2)(2)萃取温度萃取温度(3)(3)COCO2 2流量流量(4)(4)萃取时间萃取时间(5)(5)粒度粒度(6)(6)夹带剂夹带剂二.超临界CO2流体萃取工艺的影响因素1.1.超临界超临界COCO2 2流体萃取穿心莲有效成分流体萃取穿心莲有效成分功效：清热解毒、消肿止痛。功效：清热解毒、消肿止痛。有效成分：二萜内酯类化合物有效成分：二萜内酯类化合物(穿心莲内酯穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯脱水穿心莲内酯、新穿心莲内、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯酯、去氧穿心莲内酯)传统方法：传统方法：水提法：水提法：ChP1990ChP1990淘汰淘汰 醇提法：热浸：得率较高、醇提法：热浸：得率较高、有效成分容易分解或聚合有效成分容易分解或聚合、杂质较多、杂质较多 冷浸：质量较好、杂质少、有效成分不分解、冷浸：质量较好、杂质少、有效成分不分解、生产周期较长生产周期较长超临界超临界COCO2 2流体萃取法：所得有效成分含量较高、具有该药的天然香味流体萃取法：所得有效成分含量较高、具有该药的天然香味三.超临界流体萃取在天然药物提取中的应用穿心莲不同提取方法所得浸膏的质量比较穿心莲不同提取方法所得浸膏的质量比较质量指标质量指标超临界超临界COCO2 2流体流体95%95%乙醇提取乙醇提取穿心莲内酯穿心莲内酯脱水穿心莲内酯脱水穿心莲内酯总内酯含量总内酯含量总内酯提取率总内酯提取率色泽色泽气味气味杂质杂质有效成分制药干燥损失有效成分制药干燥损失成药中药粉流动性成药中药粉流动性药粉外观药粉外观药粉气味药粉气味药效药效19%19%12%12%42%42%98%98%墨绿色墨绿色(原药色原药色)原药香味原药香味少少1/101/10好好墨绿色、干爽、油脂多墨绿色、干爽、油脂多含原料药香气含原料药香气好、稳定好、稳定10%10%4%4%24%24%60%60%深棕色深棕色焦味焦味多多1/31/3差差棕色、结块、油脂少棕色、结块、油脂少无无差、不稳定差、不稳定2.2.挥发油的提取挥发油的提取传统提取方法的缺点：易造成挥发油的分解或氧化等；传统提取方法的缺点：易造成挥发油的分解或氧化等；收率普遍较低收率普遍较低实例：月见草油实例：月见草油 SFESFE提取提取,25 MPa,50,25 MPa,50 萃取率萃取率 20%20%-亚麻酸亚麻酸 10.6%10.6%色泽与透明度色泽与透明度 -亚麻酸亚麻酸 杏仁油：杏仁油：SFESFE与石油醚提取工艺比较与石油醚提取工艺比较 收油率是后者的收油率是后者的2.52.5倍倍 薄荷挥发油：薄荷挥发油：23 MPa,5523 MPa,55 加加7%7%乙醇夹带剂乙醇夹带剂 薄荷醇收率薄荷醇收率 0.16%0.16%比水蒸汽蒸馏法比水蒸汽蒸馏法 高高 3 3倍倍 比有机溶剂法比有机溶剂法 高高0.60.6倍倍 优于溶剂法四.超临界流体萃取技术展望(1)(1)成本上难以与传统提取工艺竞争成本上难以与传统提取工艺竞争(2)(2)对许多强极性和分子量较大的成分很难进行有效地对许多强极性和分子量较大的成分很难进行有效地提取提取(3)(3)基础研究比较薄弱基础研究比较薄弱(4)(4)需要结合传统中药所要求的药效来考察有效成分是需要结合传统中药所要求的药效来考察有效成分是否被萃取出及性能是否稳定否被萃取出及性能是否稳定(5)(5)考虑中药成分的协同和互溶作用考虑中药成分的协同和互溶作用u大孔树脂吸附分离技术一.大孔吸附树脂的结构、原理和特点1.1.大孔吸附树脂的结构、原理及种类大孔吸附树脂的结构、原理及种类(1)(1)结构结构 新型非离子型高分子聚合物吸附剂新型非离子型高分子聚合物吸附剂 白色球形颗粒白色球形颗粒 20-6020-60目目 具多孔性具多孔性 聚合单体聚合单体 苯乙烯苯乙烯 交联剂交联剂 二乙烯苯二乙烯苯 致孔剂致孔剂 甲苯、二甲苯甲苯、二甲苯(2)(2)分离原理分离原理 吸附性和筛选性相结合吸附性和筛选性相结合 (3)(3)大孔树脂的种类大孔树脂的种类 按化学结构分为以下四类：按化学结构分为以下四类：非极性非极性 如苯乙烯、二乙烯苯聚合物如苯乙烯、二乙烯苯聚合物 中极性中极性 存在极性基团存在极性基团COOR,COOR,具有一定的极性具有一定的极性 极性极性 含硫氧、酰胺、腈等基团含硫氧、酰胺、腈等基团 如丙烯酰胺如丙烯酰胺 极性大于酯基极性大于酯基 强极性强极性 如吡啶基、氨基等如吡啶基、氨基等 牌号牌号 生产厂生产厂 结构结构 比表面积比表面积 孔径（孔径（nmnm）非极性非极性 Amberlite XAD-2 Amberlite XAD-2 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）PS 330 4.0PS 330 4.0 Amberlite XAD-3 Amberlite XAD-3 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）PS 526 4.4PS 526 4.4 Amberlite XAD-4 Amberlite XAD-4 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）PS 750 5.0PS 750 5.0 ADS-5 ADS-5 南开大学南开大学 PS 550 20-25PS 550 20-25 ADS-3 ADS-3 南开大学南开大学 PS 1000 5-6PS 1000 5-6 Amberlite XAD-6 Amberlite XAD-6 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）-COOR 498 6.3-COOR 498 6.3 Amberlite XAD-7 Amberlite XAD-7 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）-COOR 450 8.0-COOR 450 8.0 ADS-8 ADS-8 南开大学南开大学 -COOR 140 25.0-COOR 140 25.0 Amberlite XAD-9 Amberlite XAD-9 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）Amberlite XAD-10 Amberlite XAD-10 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）250 8.0250 8.0 ADS-16 ADS-16 南开大学南开大学 酰胺酰胺 69 35.269 35.2 Amberlite XAD-11 Amberlite XAD-11 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）氧化氮类氧化氮类 170 170 Amberlite XAD-12 Amberlite XAD-12 罗姆哈斯（美）罗姆哈斯（美）氧化氮类氧化氮类 25 21.025 21.0 ADS-7 ADS-7 南开大学南开大学 -NR 200 130-NR 200 130一些代表性的大孔吸附树脂2.2.大孔吸附树脂的特点大孔吸附树脂的特点(1)(1)分离性能优良分离性能优良 选择性良好选择性良好 分离效能高分离效能高 脱色能力强脱色能力强(2)(2)理化性质稳定理化性质稳定 稳定性高稳定性高 机械强度好机械强度好 经久耐用经久耐用 避免环境污染和对设备的腐蚀避免环境污染和对设备的腐蚀(3)(3)应用范围广应用范围广 与离子交换树脂相比与离子交换树脂相比 pHpH不变不变 发酵液分离抗生素发酵液分离抗生素(4)(4)使用方便使用方便 流体阻力小流体阻力小(5)(5)溶剂用量少溶剂用量少 避免乳化现象避免乳化现象 提高提取效率提高提取效率(6)(6)可重复使用可重复使用 再生容易再生容易(7)(7)其他方面其他方面 价格较贵价格较贵 吸附效率易受流速和溶质浓度的影响吸附效率易受流速和溶质浓度的影响 品种有限品种有限 操作较复杂操作较复杂 对树脂的技术要求较高对树脂的技术要求较高二.大孔吸附树脂吸附分离技术要求大致操作步骤：树脂预处理树脂上柱药液上柱树脂的解吸 树脂的清洗、再生树脂预处理：加甲醇或丙酮浸泡24小时，加热回流洗脱装柱：蒸馏水湿法装柱，乙醇流动清洗，大量蒸馏水清洗药液的上柱吸附：（1）泄漏曲线与吸附容量的考察（2）药液上柱前的预处理（3）上柱工艺条件的选择 树脂自身特性、样品浓度、pH值、吸附柱径高比、上样流速（4）树脂的解吸 树脂的清洗、再生：无水乙醇或95乙醇洗至无色，大量水洗去醇三.大孔吸附树脂技术 在天然药物提取纯化中的应用在天然药物有效成分的提取、纯化领域大有用途：1.许多提取成功的单味中草药，奠定良好的基础2.不断有新型的吸附树脂问世到目前为止,已成功用于黄酮类、皂苷类、生物碱类、酯类、萜类等成分的分离1.1.黄酮类药物的提取黄酮类药物的提取实例：银杏叶提取物 （GBE）主要有效成分 黄酮苷 萜内酯 溶剂萃取法 24 6 树脂吸附法 Amberlite XAD-7 30 未达标 Duolite-761 达标 达标 ADS-F8 6065 2530 其他中草药：毛冬青根、山楂、葛根、黄芩根、苦荞麦、沙棘等2.2.皂苷类药物的提取皂苷类药物的提取实例：绞股蓝皂苷 研制出强极性吸附树脂ADS-7、S-038 S-038，吸附量达65.5 mg/ml，70乙醇洗脱 人参皂苷 吸附和脱色双重作用 ADS-7，70乙醇洗脱，粗品（棕色）白色或微黄色实例：绞股蓝皂苷 绞股蓝：葫芦科植物绞股蓝的根状茎或全草，多年生草质藤本植物 功效：镇咳、清热解毒有效成分：皂苷、黄酮类、多糖类 “绿色的金子”“第二人参”“人参宝草”提取工艺：绞股蓝干茎叶 热水浸提 浸提除杂 树脂吸附乙醇解吸 脱色 浓缩干燥 粉碎 绞股蓝皂苷粉末7-8倍热水浸提三次调节酸碱性静置除杂DA大孔树脂水洗除杂50%乙醇70%乙醇DB树脂真空干燥80-100目3.3.生物碱的提取生物碱的提取实例：喜树碱 弱碱 AB-8 pH 8，盐浓度(1-2.5)mol/L,吸附量达160 mg/g 小檗碱 碱性大 水溶性大 10%H2SO4,10%NaOH,非极性吸附树脂 小檗碱含量为原生药含量的97%4.4.影响大孔树脂分离纯化天然药物效果的因素影响大孔树脂分离纯化天然药物效果的因素(1)(1)树脂性质树脂性质 吸附容量大吸附容量大 吸附速度快吸附速度快 机械强度好机械强度好(2)(2)药液药液pHpH 酸性物质易在酸性溶液中被吸附酸性物质易在酸性溶液中被吸附 碱性物质在碱性溶液中被吸附碱性物质在碱性溶液中被吸附(3)(3)药液浓度药液浓度 符合符合Frendich Frendich 和和 AugmurAugmur经典吸附式经典吸附式 (4)(4)上柱液温度上柱液温度 室温室温(5)(5)盐浓度盐浓度 无机盐的加入降低了吸附质在介质内的溶解度无机盐的加入降低了吸附质在介质内的溶解度(6)(6)树脂柱径高比树脂柱径高比 合适的径高比为分离提供较高的柱效合适的径高比为分离提供较高的柱效(7)(7)树脂柱的清洗树脂柱的清洗 非吸附性成分非吸附性成分 水水 吸附性杂质吸附性杂质 一定浓度的酸或碱液一定浓度的酸或碱液(0.1-1.0 M NaOH(0.1-1.0 M NaOH 或或 HCl)HCl)(8)(8)洗脱液的选择及解吸洗脱液的选择及解吸u制备色谱技术色谱技术：有效成分的定性与定量工作开发出疗效好、质量指标明确的中药新药一.色谱技术的基本原理按照分离过程的原理不同分为：1.吸附色谱2.分配色谱3.离子交换色谱4.凝胶色谱5.亲和色谱二.制备色谱工艺流程单色谱柱：最简单、最为常用，能分离复杂组分的混合物单色谱柱：最简单、最为常用，能分离复杂组分的混合物 溶剂消耗量大，回收溶剂的能耗高溶剂消耗量大，回收溶剂的能耗高模拟移动床色谱：分离效率高、溶剂消耗低、便于连续操作模拟移动床色谱：分离效率高、溶剂消耗低、便于连续操作 设备复杂、工艺要求高设备复杂、工艺要求高柱切换、移动进料和移动接口色谱等：柱切换、移动进料和移动接口色谱等：实现复杂组分分离、大大提高吸附剂生产率、实现复杂组分分离、大大提高吸附剂生产率、减少溶剂消耗、减少设备投资和操作费用减少溶剂消耗、减少设备投资和操作费用三.常用的制备色谱工艺1.薄层色谱 操作简单、费用低廉、应用广泛新型薄层色谱法 离心制备薄层色谱（PCLC）旋转离心、连续洗脱的圆形色谱技术，分离效果优于常规的制备薄层色谱和柱色谱独特的优点：u 对固定相不会造成损坏u 装填容量、分离速度和分离效能得到极大提高实例：龙胆属植物 Sstrictiffora 甲醇提取物 bellidifolin 和 desmethylbellidifolin 离心薄层色谱法 聚酰胺开口柱色谱 30 min.12hr.2.柱色谱特殊的柱色谱：（1）干柱色谱干法装填上样洗脱推出、切割谱带溶剂萃取特点：溶剂消耗很少，操作迅速（1530min）（2）真空液相色谱(VLC)抽真空装柱低极性溶剂冲柱上样洗脱收集馏分、抽干特点：操作简便、处理量大（一次可达30g）3.压力液相色谱(PLC)(1)闪蒸色谱(约0.2 MPa)价格低廉、操作方便(2)低压液相色谱(2.0 MPa)分离效率高、应用范围广实例：银杏内酯A、银杏内酯B、白果内酯的分离纯化硅胶H柱(10-40 m)流动相：乙酸乙酯石油醚（8：2）(5)超临界流体色谱 介于液相色谱和气相色谱之间的色谱方法特点：分离速度快、产品易回收、应用范围广、有可能替代正相HPLC4.离子交换色谱固定相：离子交换树脂 可再生性和重复使用性交换功能基团：阳离子和阴离子形态：凝胶型（水溶胀）和大孔型（永久性微孔）特点：使用方便、成本低廉、重复使用性好、分离速度快应用范围：生物碱、糖类、氨基酸、蛋白质以及核酸实例：总生物碱制备生药粗粉0.1%HCl渗漉强酸性阳离子交换树脂蒸馏水洗树脂倒出晾干10%NaOH碱化树脂氯仿回流干燥重结晶 5.逆流色谱(CCC)以液相物质为固定相的液液色谱离心逆流色谱(CCCC)：（1）分离物质的极性范围很宽（2）没有拖尾现象（3）样品定量回收实例：银杏叶中的黄酮糖苷 固定相：水，流动相：乙酸乙酯乙酸乙酯（异丁醇）乙酸乙酯/异丁醇(6:4)高速逆流色谱(HSCCC)6.其他形式色谱(1)体积排阻色谱 分子筛机理凝胶过滤色谱凝胶渗透色谱优点：操作简单、快捷、流动相选择宽泛(2)亲和色谱 大多被利用来分离纯化生物大分子载体：琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶(3)疏水作用色谱 主要分离对象为蛋白质特点：分离条件温和，易于保持生物蛋白质的活性7.多种色谱方法的联用最初分离步骤：如闪蒸色谱、逆流色谱或凝胶过滤色谱等最后的纯化过程：如HPLC实例：生物碱 液相色谱法排阻色谱法实例：水飞蓟黄酮的提取 水飞蓟：也叫乳蓟，菊科植物，一年或两年生草本 功效：抗肝脏中毒和保护肝细胞有效成分：水飞蓟素提取工艺：水飞蓟种子 去油种子饼 去油种子渣 过滤 提取液 浓缩 总黄酮油液 总黄酮 溶解 上柱 洗脱 浓缩干燥 水飞蓟素机械榨油粉碎提取4次每次4h分离植物油丙酮硅胶柱四.制备色谱技术的发展关键：色谱过程放大和操作最优化关键：色谱过程放大和操作最优化柱色谱：分辩率高、结合容量大、成本低、放大快速简便柱色谱：分辩率高、结合容量大、成本低、放大快速简便 现有色谱分离工艺现有色谱分离工艺7070连续性色谱技术：移动床色谱、环形色谱、错流梯度色谱连续性色谱技术：移动床色谱、环形色谱、错流梯度色谱 模拟流动床模拟流动床SMBSMB：特点：设备结构小、放大快速简便、产率高和生产能力大特点：设备结构小、放大快速简便、产率高和生产能力大u指纹图谱技术一.概述1.1.中药指纹图谱：中药指纹图谱：运用光谱、色谱、运用光谱、色谱、X-X-射线衍射或各种技术的联用等现代分析技术，对中药化学射线衍射或各种技术的联用等现代分析技术，对中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图等）方式进行表征，并信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图等）方式进行表征，并通过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。通过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。制备分析比较评价校验制备分析比较评价校验分析图谱：准确的辨认 精密的测量比较图谱：相似 相同评价结果：模糊属性 求索细枝末节 分析比较的结果：对差异性或一致性作出评价2.2.中药指纹图谱的分类：中药指纹图谱的分类：狭义：狭义：中药化学（成分）指纹图谱中药化学（成分）指纹图谱广义：广义：中药材（原料药材）指纹图谱中药材（原料药材）指纹图谱应用对象应用对象 中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱 中药制剂指纹图谱中药制剂指纹图谱 中药化学（成分）指纹图谱中药化学（成分）指纹图谱 最主要、常用最主要、常用 中药中药HPLCHPLC指纹指纹测定手段测定手段 中药生物指纹图谱中药生物指纹图谱3.3.中药指纹图谱研究的目的及意义：中药指纹图谱研究的目的及意义：目的：目的：（1 1）对中药质量控制的补充和提高对中药质量控制的补充和提高（2 2）控制中间体、成品的一致性，减少批间差异）控制中间体、成品的一致性，减少批间差异意义：意义：中药现代化中药现代化 表征中药有效物质的整体性和复杂性表征中药有效物质的整体性和复杂性 推动中药新药研究开发和传统产品的二次开发推动中药新药研究开发和传统产品的二次开发4.4.中药指纹图谱建立的原则：中药指纹图谱建立的原则：系统化学成分研究和相同的药理学研究为依托系统化学成分研究和相同的药理学研究为依托系统性：系统性：应包括中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部应包括中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部 如：中药人参如：中药人参 皂苷类成分皂苷类成分 银杏叶银杏叶 黄酮类和银杏内酯类黄酮类和银杏内酯类特征性：特征性：化学成分信息具有高度选择性，区分中药的真伪和优劣，成为化学成分信息具有高度选择性，区分中药的真伪和优劣，成为“化学条码化学条码”如：五味子如：五味子 已知木脂素已知木脂素 未知木脂素未知木脂素 成分之间的顺序、比值成分之间的顺序、比值重现性：重现性：在规定的方法和条件下，不同操作者和不同实验室应能做出指纹图谱在规定的方法和条件下，不同操作者和不同实验室应能做出指纹图谱二.中药指纹图谱的建立1.1.指纹图谱测定方法的选定指纹图谱测定方法的选定uu色谱法：色谱法：TLCTLC、HPLCHPLC、GCGC、CECEuu光谱法：光谱法：UVUV、IRIR、NIRNIRuu其他方法：其他方法：X X射线衍射法、射线衍射法、NMRNMR及联用技术等及联用技术等uuHPLCHPLC法最常用，具有如下特点：法最常用，具有如下特点：分离效能高分离效能高 选择性高选择性高 检测灵敏度高检测灵敏度高 分析速度快分析速度快 应用范围广应用范围广HPLCHPLC指纹图谱测定方法的选定指纹图谱测定方法的选定(1)(1)研究对象的确定及预处理研究对象的确定及预处理 文献调研，确定分析检测目标文献调研，确定分析检测目标 例如：例如：黄芪黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效成分含黄酮、皂苷及多糖三类有效成分 黄芪多糖注射液黄芪多糖注射液 多糖多糖 原药材原药材 黄酮、皂苷及多糖黄酮、皂苷及多糖 复方：复方：君臣君臣佐使佐使 供试品的制备供试品的制备 例如：例如：黄芪黄芪 黄酮黄酮 碱水萃取碱水萃取 皂苷皂苷 大孔树脂吸附大孔树脂吸附 除杂，避免干扰或对色谱柱的损耗除杂，避免干扰或对色谱柱的损耗(2)(2)色谱条件选择色谱条件选择 最重要、关键性最重要、关键性 流动相：对样品有一定溶解度、适用于使用的监测器、化学惰性好、低黏度、低沸点流动相：对样品有一定溶解度、适用于使用的监测器、化学惰性好、低黏度、低沸点 纯度高、安全、毒性低、环境友好纯度高、安全、毒性低、环境友好 改性剂、助溶剂（异丙醇、四氢呋喃、氯仿）改性剂、助溶剂（异丙醇、四氢呋喃、氯仿）、梯度洗脱、梯度洗脱 检测波长、柱温、色谱柱、进样量、检测器检测波长、柱温、色谱柱、进样量、检测器黄酮类、酚酸类 乙腈水酸系统皂苷类 乙腈水系统生物碱类 乙腈三乙胺系统2.2.色谱条件的优化及规范化色谱条件的优化及规范化 (1)(1)样品中所有组分能被检出或检出组分数目尽可能多样品中所有组分能被检出或检出组分数目尽可能多 (2)(2)各组分达到满意的分离度各组分达到满意的分离度 (3)(3)分析时间短分析时间短优化：流动相组成、浓度、值、添加剂优化：流动相组成、浓度、值、添加剂规范化：色谱柱、试剂、仪器操作参数固定，可重现规范化：色谱柱、试剂、仪器操作参数固定，可重现3.3.指纹图谱的信息化和知识化指纹图谱的信息化和知识化uu指纹图谱信息化指纹图谱信息化uu指纹图谱知识化指纹图谱知识化4.4.指纹图谱的建立与辨认指纹图谱的建立与辨认三.中药指纹图谱的应用1.1.丹参药材指纹图谱研究丹参药材指纹图谱研究 有效成分：有效成分：水溶性水溶性 丹参素丹参素、原儿茶醛原儿茶醛、原儿茶酸、丹参素丙、丹参酸乙、丹酚酸、原儿茶酸、丹参素丙、丹参酸乙、丹酚酸A A、丹酚酸、丹酚酸 B B、迷迭香酸、丹参酸、迷迭香酸、丹参酸 A A、3,4-3,4-二羟基桂皮酸、二羟基桂皮酸、-谷甾醇谷甾醇-葡萄糖苷、异阿魏酸、葡萄糖苷、异阿魏酸、原紫草素、紫草酸原紫草素、紫草酸 脂溶性成分脂溶性成分 丹参酮类丹参酮类 （丹参酮丹参酮A A）(1)(1)供试品的制备供试品的制备 水提取酸化乙酸乙酯萃取检测水提取酸化乙酸乙酯萃取检测 方法简便、重现性好方法简便、重现性好(2)(2)参照物的制备参照物的制备 主成分：原儿茶醛作参照物主成分：原儿茶醛作参照物(3)(3)检测方法检测方法 流动相的选择流动相的选择 甲醇甲醇-0.1%-0.1%冰乙酸（冰乙酸（5:955:95）检测波长检测波长 254 nm 254 nm 稳定性及精密度试验稳定性及精密度试验 相对标准偏差相对标准偏差 3.0%3.0%重现性试验重现性试验 相对标准偏差相对标准偏差 3.0%3.0%(4)(4)丹参原药材丹参原药材HPLCHPLC指纹图谱检测标准指纹图谱检测标准 色谱条件与系统适用性试验：色谱条件与系统适用性试验：填充剂填充剂 ODSODS 流动相流动相 甲醇甲醇-0.1%(5:95)-0.1%(5:95)检测波长检测波长 254 nm254 nm 柱温柱温 室温室温 流速流速 1.0 mL/min1.0 mL/min 参照物溶液的制备参照物溶液的制备 精密称取对照品精密称取对照品 2.0 mg2.0 mg，5mL5mL定容定容 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 药材粉碎过筛加热回流滤液酸化乙酸乙酯萃取残渣甲醇溶解药材粉碎过筛加热回流滤液酸化乙酸乙酯萃取残渣甲醇溶解 测定法测定法 进样量进样量 1010 L L 记录记录1h 1h (1)danshensu(2)protocatechuic acid(3)protocatechuic aldehydrate(4)caffeic acid(5)rosmarinic acid(6)lithospermic acid(7)salvianolic acid B(8)salvianolic acid A(9)salvianolic acid C.相对保留时间相对保留时间/min/min0.150.150.3680.3680.4370.4370.4950.4950.5910.5911.000(S)1.000(S)特征指纹峰积分相对比值特征指纹峰积分相对比值0.1520.152 30%30%0.720.720.1910.191 30%30%0.2970.297 25%25%0.0460.0461.000(S)1.000(S)相对保留时间相对保留时间/min/min1.1431.1431.3931.3931.6271.6272.5852.5852.9112.9113.9683.968特征指纹峰积分相对比值特征指纹峰积分相对比值0.0590.0590.0380.0380.1390.1390.3540.354 25%25%0.4110.411 25%25%0.0540.054丹参原药材HPLC指纹图谱数据三.中药指纹图谱的应用2.2.冬虫夏草原药材指纹图谱研究冬虫夏草原药材指纹图谱研究 有效成分：有效成分：核苷类核苷类、甾醇类及多糖、甾醇类及多糖