人教版生物选修三1.1DNA重组技术的基本工具课件.ppt

专题专题1 1 基因工程基因工程1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具一、基因工程的原理一、基因工程的原理1 1、概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因、概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取提取出来，加以出来，加以修饰改造修饰改造，然后放到，然后放到另一种另一种生物的生物的细胞里，细胞里，定向定向地改造生物的地改造生物的遗传性状遗传性状。基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术2、别称：、别称：生物体外生物体外3、操作环境：、操作环境：基因基因/DNA/DNA4、操作对象：、操作对象：分子水平分子水平5、操作水平：、操作水平：6、基本过程：、基本过程：剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达7、原理：、原理：基因重组基因重组8、结果：、结果：人类需要的基因产物人类需要的基因产物9、优点：、优点：定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍。和障碍。基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程 DNADNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明DNADNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译遗传密码的破译基因转移载体的发现基因转移载体的发现工具酶的发现工具酶的发现DNADNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明DNADNA体外重组的实现体外重组的实现重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世PCRPCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明1 1、基因拼接的理论基础、基因拼接的理论基础（1 1）DNADNA是生物的主要遗传物质。是生物的主要遗传物质。（2 2）DNADNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。（3 3）双链）双链DNADNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。二、基因工程诞生的理论基础二、基因工程诞生的理论基础2 2、外源基因在受体内表达的理论基础、外源基因在受体内表达的理论基础（1 1）基因是控制生物性状的独立遗传单位。）基因是控制生物性状的独立遗传单位。（2 2）遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息）遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。流动方向。（3 3）生物界共用一套遗传密码。）生物界共用一套遗传密码。准确切割准确切割DNADNA的工具（的工具（“分子手术刀分子手术刀”）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”）DNADNA连接酶连接酶基因转移工具（基因转移工具（“分子运输车分子运输车”）基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体三、三、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1 1、限制性核酸内切酶（限制酶）、限制性核酸内切酶（限制酶）“分子手术刀分子手术刀”（1 1）来源：主要是从）来源：主要是从_中分离纯化出来的。中分离纯化出来的。原核生物原核生物a.a.限制酶就是细菌的一种限制酶就是细菌的一种防御性防御性工具，防止外来病工具，防止外来病原物的侵害。当外源原物的侵害。当外源DNADNA侵入时，会利用限制酶将外侵入时，会利用限制酶将外源源DNADNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到原核生物中主要起到切割外源切割外源DNADNA、使之失效、使之失效，从而，从而达到达到保护自身保护自身的目的。的目的。b.b.含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或者不具备分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。其切开。为什么限制酶不切割细菌本身的为什么限制酶不切割细菌本身的DNA?DNA?（2 2）化学本质：）化学本质：蛋白质蛋白质（3 3）作用：）作用：催化催化磷酸二酯键的断裂，可重复利用。用于磷酸二酯键的断裂，可重复利用。用于DNADNA的切割以获取目的基因的切割以获取目的基因和和载体的切割载体的切割。（5 5）作用特点：）作用特点：专一性专一性，限制酶能够识别双链，限制酶能够识别双链DNADNA分子分子中的某种中的某种特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，并且使每，并且使每一条链中一条链中特定部位的两个核苷酸之间的特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开。磷酸二酯键磷酸二酯键（4 4）作用部位：）作用部位：磷酸二酯键：两磷酸二酯键：两个核苷酸分子核个核苷酸分子核苷酸残基的两个苷酸残基的两个羟基分别与同一羟基分别与同一磷酸基团形成的磷酸基团形成的共价连接键。共价连接键。黏性末端黏性末端限制酶限制酶(EcoREcoR)能识别能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。EcoR黏性末端黏性末端EcoREcoR限制限制酶酶被同一种限制酶切断的几个被同一种限制酶切断的几个DNADNA是否具有相同的黏性是否具有相同的黏性末端？末端？要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶断几个要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶断几个磷酸二酯键？可产生几个黏性末端？磷酸二酯键？可产生几个黏性末端？断断断断4 4 4 4个磷酸二酯键，产生四个黏性末端个磷酸二酯键，产生四个黏性末端个磷酸二酯键，产生四个黏性末端个磷酸二酯键，产生四个黏性末端（6 6）限制酶所识别的序列的特点：）限制酶所识别的序列的特点：大多数大多数限制酶的识别限制酶的识别序列由序列由6 6个个核苷酸组成。也核苷酸组成。也有少数限制酶的识别序列有少数限制酶的识别序列由由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成。个核苷酸组成。限制酶所识别的序列，限制酶所识别的序列，可以找到一条中心轴线，可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNADNA上的上的碱基是碱基是反向对称重复排列反向对称重复排列的。的。另外，能被限制酶特另外，能被限制酶特异性识别的切割部位基本异性识别的切割部位基本都具有都具有回文序列回文序列：在切割：在切割部位，一条链正向读的碱部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。的顺序完全一致。错位切：产生两个相同的黏性末端错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端平切：形成平末端（7 7）切割方式及产生的）切割方式及产生的DNADNA末端形式：末端形式：2 2、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”（1 1）种类：根据酶的来源不同）种类：根据酶的来源不同 E.coliDNA连接酶连接酶（从大肠杆菌来）（从大肠杆菌来）T4DNA连接酶连接酶（从（从T4噬菌体来）噬菌体来）（2 2）作用部位：）作用部位：磷酸二酯键磷酸二酯键 （3 3）作用：）作用：将双链将双链DNADNA片段片段“缝合缝合”起来，起来，恢复恢复被限制被限制酶切开的两个核苷酸之间的酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键。E.coliDNA连接酶连接酶只能将双链只能将双链DNA片段互补的片段互补的黏性末端黏性末端之间连接起来。之间连接起来。T4DNA连接酶连接酶既可以既可以“缝合缝合”双链双链DNA片段片段互补的互补的黏性末端黏性末端，又可以，又可以“缝合缝合”双链双链DNA片段片段的的平末端平末端，但连接，但连接平末端平末端之间的之间的效率比较低效率比较低。可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙缝隙缝隙“缝合缝合缝合缝合”起来，起来，起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合缝合缝合”起来，起来，起来，起来，但效率较低但效率较低但效率较低但效率较低T4DNA连接酶连接酶（4 4）比较：）比较：DNADNA连接酶、连接酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、RNARNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶RNARNA聚合酶聚合酶不同不同点点连接连接DNADNA片段，片段，将将DNADNA双双链的链的两个缺口同时两个缺口同时连接连接起来起来连接游离的脱氧核连接游离的脱氧核苷酸，苷酸，将将将将单个脱氧单个脱氧核苷酸核苷酸连接成连接成一条一条互补的互补的DNADNA链链连接游离的核连接游离的核糖核苷酸，将糖核苷酸，将其连接成其连接成RNARNA不需要模板不需要模板需要模板需要模板需要模板需要模板相相同同点点化学本质：化学本质：_；具有酶的基本特点：具有酶的基本特点：_ _ _ 、_、_ 都能形成都能形成_键；键；蛋白质蛋白质高效性、专一性、需要适宜的条件高效性、专一性、需要适宜的条件磷酸二酯磷酸二酯限制酶限制酶DNADNA解旋酶解旋酶区别区别切割切割特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列的的磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNADNA两条链的两条链的氢键氢键打打开形成两条单链开形成两条单链限制性内切酶与限制性内切酶与DNADNA解旋酶解旋酶3 3、基因进入受体细胞的、基因进入受体细胞的载体载体-“分子运输车分子运输车分子运输车分子运输车”（1 1）载体的作用：）载体的作用：将将外源基因转移外源基因转移到受体细胞中去。到受体细胞中去。利用载体在受体细胞内，对外源基因进行大利用载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。量复制。（2 2）载体必须具备的条件：）载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接；因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ）对受体细胞无害对受体细胞无害（3 3）常用的载体有：质粒，）常用的载体有：质粒，噬菌体的衍生物，动噬菌体的衍生物，动植物病毒等植物病毒等常用的载体：质粒常用的载体：质粒（1 1）裸露的、结构简单、独立）裸露的、结构简单、独立于细菌拟核于细菌拟核DNADNA之外，并具有自之外，并具有自我复制能力的小型双链环状我复制能力的小型双链环状DNADNA分子分子（2 2）具有一个或多个限制酶切）具有一个或多个限制酶切割位点，供外源割位点，供外源DNADNA片段（基因）片段（基因）插入插入（3 3）携带外源）携带外源DNADNA片段在受体细片段在受体细胞中自我复制，或整合到染色体胞中自我复制，或整合到染色体DNADNA上，随染色体上，随染色体DNADNA同步复制同步复制（4 4）具有标记基因，如四环素）具有标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，供重组等，供重组DNADNA的鉴定和选择的鉴定和选择（5 5）用作载体的质粒，都是在）用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改天然质粒的基础上进行过人工改造的。造的。注意：注意：必修二教材说法：必修二教材说法：1 1、运载体、运载体2 2、常用运载体：质粒、噬菌体、动植、常用运载体：质粒、噬菌体、动植物病毒等。物病毒等。3 3、质粒存在于许多细菌以及酵母菌等、质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中，是拟核或细胞核外能够生物的细胞中，是拟核或细胞核外能够自主复制的很小的环状自主复制的很小的环状DNADNA分子。分子。有关基因工程概念的理解正确的是有关基因工程概念的理解正确的是A A操作对象是脱氧核苷酸操作对象是脱氧核苷酸 B B对对DNADNA进行改造只能在细胞内完成进行改造只能在细胞内完成C C打破远缘杂交不育的障碍打破远缘杂交不育的障碍 D D不能定向改造生物的遗传性状不能定向改造生物的遗传性状C下列有关基因工程技术的叙述下列有关基因工程技术的叙述,正确的是（正确的是（）A.A.重组重组DNADNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体B.B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C.C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快 D.D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达只要目的基因进入受体细胞就能实现表达C在基因工程中，切割运载体和含有目的基因在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的的DNADNA片段，需使用（片段，需使用（）A.A.同种限制酶同种限制酶 B.B.两种限制酶两种限制酶C.C.同种连接酶同种连接酶 D.D.两种连接酶两种连接酶基因工程常用的受体细胞有（基因工程常用的受体细胞有（）（1 1）大肠杆菌）大肠杆菌 （2 2）枯草杆菌）枯草杆菌（3 3）支原体）支原体 （4 4）动植物细胞）动植物细胞A.A.（3 3）（）（4 4）B.B.（1 1）（）（2 2）（）（4 4）C.C.（2 2）（）（3 3）（）（4 4）D.D.（1 1）（）（2 2）（）（3 3）下列关于限制酶的说法正确的是（下列关于限制酶的说法正确的是（）A.A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B.B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C.C.不同的限制酶切割不同的限制酶切割DNADNA后都会形成黏性末端后都会形成黏性末端D.D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键B不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A A、能复制、能复制 B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因 D D、它是环状、它是环状DNADNAD据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（）A.A.限制性内切酶可以切断限制性内切酶可以切断a a处，处，DNADNA连接酶可以连接酶可以连接连接a a处处B.DNAB.DNA聚合酶可以连接聚合酶可以连接a a处处C.C.解旋酶可以使解旋酶可以使b b处解开处解开D.D.连接连接C C处的酶可以为处的酶可以为DNADNA连接酶连接酶D下列关于下列关于DNADNA连接酶作用的叙述，正确的是连接酶作用的叙述，正确的是A.A.将单个核苷酸加到某将单个核苷酸加到某DNADNA片段末端，形成磷酸二酯键片段末端，形成磷酸二酯键B.B.将断开的两个将断开的两个DNADNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸片段的骨架连接起来，重新形成磷酸 二酯键二酯键C.C.连接两条连接两条DNADNA链上碱基之间的氢键链上碱基之间的氢键D.D.只能将双链只能将双链DNADNA片段互补的黏性末端之间连接起来，片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链而不能将双链DNADNA片段平末端之间进行连接片段平末端之间进行连接BA、BamHI和和EcoRI；末端互补序列；末端互补序列AATT B、BamHI和和Hind；末端互补序列；末端互补序列GATCC、EcoRI和和Hind；末端互补序列；末端互补序列AATTD、BamHI和和BglII；末端互补序列；末端互补序列GATC限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上分子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶BamHI，EcoRI，Hind以及以及Bgl的辨识序列。箭头表示的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？（的末端互补序列为何？（）D以下是两种限制酶切割后形成的以下是两种限制酶切割后形成的DNADNA片段，试分析：片段，试分析：GCGC AATTC AATTC GC GC CTTAACTTAA CG CG G G CG CG G G（1 1）其中）其中和和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNADNA分子，所用分子，所用DNADNA连接酶通连接酶通常是常是 。（2 2）和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNADNA片段，所用的连接酶通常是片段，所用的连接酶通常是 。T T4 4DNADNA连接酶连接酶T4DNA连接酶或连接酶或E.coliDNA连接酶连接酶