第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构(精品).ppt
核磁共振方法解析蛋白质结构核磁共振方法解析蛋白质结构核磁共振是解析蛋白质结构的一种重要方法核磁共振是解析蛋白质结构的一种重要方法优点：不需结晶；可研究动力学。优点：不需结晶；可研究动力学。缺点：受分子量限制，需要标记。缺点：受分子量限制，需要标记。Malate synthase G(82kDa)Richard Robert Ernst Ernst was awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1991 for his contributions towards the development of Fourier Transform nuclear magnetic resonance spectroscopy and the subsequent development of multi-dimensional NMR techniques.Kurt Wthrich He was awarded half of the Nobel Prize in Chemistry in 2002 for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution.核磁共振的原理核磁共振的原理自旋量子数（自旋量子数（I）原子序数和原子质量都为偶数：原子序数和原子质量都为偶数：I=0I=0(1212C,C,1616O)O)原子序数为奇数，原子质量为偶数：原子序数为奇数，原子质量为偶数：I=整数整数(1414N,N,2 2H,H,1010B)B)原子质量为奇数：原子质量为奇数：I=半整数半整数(1 1H,H,1313C,C,1515N,N,3131P)P)自旋状态（自旋状态（M）M M=I,(I-1),(I-2),=I,(I-1),(I-2),-I,-I 对于对于1 1H H,1313C,C,1515N,N,3131P P 来说来说:M M=1/2,-1/2=1/2,-1/2凡自旋不为零的原子核，在外加静磁场中发生凡自旋不为零的原子核，在外加静磁场中发生能能级裂分级裂分，共振吸收一特定频率的射频电磁场能量，共振吸收一特定频率的射频电磁场能量的现象，即为核磁共振。的现象，即为核磁共振。Bo=0Bo 0E=h Bo/2=h a ab b为磁旋比，由核的性质所决定。为磁旋比，由核的性质所决定。核磁共振的灵敏度核磁共振的灵敏度 N-N N/N=e E/kT E=h Bo/2 对于在 400 MHz(BoBo=9.5 T)磁场下的1H：N/N=1.000064磁场越强，灵敏度越高磁场越强，灵敏度越高磁旋比越大，灵敏度越高磁旋比越大，灵敏度越高 1H=26.75 rad/G；13C=6.73 rad/G；15N=-2.71rad/G核的丰度越高，灵敏度越高核的丰度越高，灵敏度越高1H谱谱 天然丰度高；灵敏度高。13C谱谱 天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好15N谱谱 天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好核磁共振的频率核磁共振的频率 E=h Bo/2 =Bo/2 E=h 在常用磁体（2.35-18.6 T）下，1H 的共振频率在100-800MHz范围，13C为它的1/4，15N为它的1/10。10-1010-8 10-6 10-4 10-2 100 102 wavelength(cm)g-rays x-rays UV VIS IR m-wave radio进动进动(larmor)频率频率 =2 0=B0核磁共振的主要参数核磁共振的主要参数化学位移化学位移耦合常数耦合常数峰强峰强核欧佛豪斯效应（核欧佛豪斯效应（NOENOE）横向驰豫时间横向驰豫时间纵向驰豫时间纵向驰豫时间线宽线宽化学位移化学位移 不同的原子处于不同的化学环境，即处于不同的电磁环境,因此表现出不同的共振频率：=（BoBoB B）/2/2 =2=2=(BoBoB B)逆磁屏蔽逆磁屏蔽微磁环境微磁环境B Beffeff=B=B0 0-B-Blocloc-B-Beffeff=B=B0 0(1-(1-)化学位移的表示方法化学位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH3AromaticIminesAmidesHCb b,g g,d d,.HCa awater10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0影响化学位移的效应：影响化学位移的效应：1.环流位移效应 环状分子的大电子云产生的附加磁场对核的影响2.顺磁离子效应 金属离子对周围核的影响3.pH滴定效应 不同pH下各基团解离情况的不同对化学位移的影响耦合常数耦合常数自旋耦合自旋耦合 共价键（1-4个键）相连核之间的特性张量的相互作用13C1H1H1Hone-bondthree-bond自旋裂分自旋裂分 由于被测核与相邻核自旋耦合引起的谱线裂分，裂分的大小称为耦合常数耦合常数aaabbabbI SSSIIJ(Hz)耦合常数不随磁场的变化而变化耦合常数不随磁场的变化而变化两核耦合引起对方谱线裂分的大小相等两核耦合引起对方谱线裂分的大小相等相距越远、所隔键数越多，耦合越弱相距越远、所隔键数越多，耦合越弱重原子比轻原子耦合强重原子比轻原子耦合强耦合常数的大小与耦合核的二面角有关耦合常数的大小与耦合核的二面角有关峰强、驰豫和线宽峰强、驰豫和线宽峰强与共振粒子数成正比。峰强与共振粒子数成正比。纵向驰豫是高能原子核将其多余能量交给周围介纵向驰豫是高能原子核将其多余能量交给周围介质而返回低能态的过程。质而返回低能态的过程。横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量的相移。的相移。由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横向驰豫时间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和向驰豫时间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和分子内部运动性等影响线宽。分子内部运动性等影响线宽。纵向驰豫（纵向驰豫（T1T1）横向驰豫（横向驰豫（T2T2）NOENOE不同核之间通过空间的偶极相互作用，其强度与不同核之间通过空间的偶极相互作用，其强度与核间距的六次方成反比。核间距的六次方成反比。若用射频照射核若用射频照射核A A，其谱峰被抑制，与其空间靠近，其谱峰被抑制，与其空间靠近的另一核的另一核B B的谱峰会略有增强，其增强的程度，即的谱峰会略有增强，其增强的程度，即为为NOENOE强弱的度量。强弱的度量。因因NOENOE的强度与核间距有关，所以是分子结构中的的强度与核间距有关，所以是分子结构中的最重要参数。最重要参数。一维谱一维谱共振峰强度随频率（化学位移）变化共振峰强度随频率（化学位移）变化二维谱二维谱吸收峰强度对两个频率变量作图COSYCOSYTOCSYTOCSYNOESYNOESY1H1H共振的分布共振的分布异核二维谱异核二维谱多维谱多维谱多维多维NMRNMR解析蛋白质结构解析蛋白质结构谱峰认证谱峰认证自旋体系认证自旋体系认证序列认证序列认证NOENOE认证认证TOCSY NOESYLeuAlaAsnGlyNHHCLeuAlaAsnGlyNHHC用于用于NMRNMR结构计算的约束结构计算的约束NOENOE5 5 化学位移化学位移二级结构二级结构偶极常数偶极常数二面角二面角氢氘交换氢氘交换氢键氢键顺磁驰豫增强顺磁驰豫增强(PRE)(PRE)远距离（远距离（3030）残余偶极耦合残余偶极耦合(RDC)(RDC)空间定向空间定向特征特征NOENOE与二级结构与二级结构化学位移与二级结构化学位移与二级结构偶极耦合与二面角偶极耦合与二面角氢氘交换与结构和氢键氢氘交换与结构和氢键4.04.0(Has)4.08.0(NHs)7.0t=0-No D2OAdd D2Ot=t1t=t2由核磁数据构建蛋白质溶液三维结构由核磁数据构建蛋白质溶液三维结构Strong NOE1.8-2.7 Medium NOE1.8-3.3 Weak NOE1.8-5.0 3JNa a 5 Hz -80 f f 8 Hz -160 f f -80核磁共振谱仪的组成核磁共振谱仪的组成MagnetProbeConsoleComputer对对磁体磁体的要求的要求高磁场强度高磁场强度高稳定性高稳定性高均匀性高均匀性高磁场强度：高分辨率高灵敏度高磁场强度：高分辨率高灵敏度信噪比的完全方程信噪比的完全方程样品的准备样品的准备溶剂的选择溶剂的选择 1.样品在其中有高溶解度；2.在我们所感兴趣的波谱范围内没有溶剂峰；3.在做变温实验的温度范围内保持液体状态。通常使用一些氘代溶剂通常使用一些氘代溶剂 减少溶剂峰的干扰 采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用 H2O 是生物分子最适宜的溶剂(90%H2O,10%D2O)蛋白质蛋白质NMRNMR研究的溶液条件研究的溶液条件pH不要大于7。缓冲体系要保证蛋白质的稳定及高溶解度。蛋白质的浓度通常要求有数mM。避免缓冲液中其他成份对蛋白质谱图的干扰。无机盐浓度不宜大于数百mM。在样品溶液中不能有重金属离子污染。通常加入1mM左右NaN3以避免样品长霉菌。思考题思考题一个原子在500MHz谱上的化学位移是8ppm，它在800MHz的谱上的化学位移是多少Hz?一个共振峰在500MHz谱上的耦合常数是10Hz，它在800MHz谱上的耦合常数是多少ppm？样品浓度增加一倍，场强增加一倍，信噪比各增加多少？为什么？
