课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(精品).pptx

2.22.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数学习目标：学习目标：(1)从土壤中分离出能够分从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；解尿素的细菌；(2)统计每克土壤样品中究统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。竟含有多少这样的细菌。培养基配方培养基配方KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g尿素尿素1.0g琼脂琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL在微生物学中，将允许特定种在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。选择培养基1直接计数法：直接计数法：最常用显微镜直接计数法。最常用显微镜直接计数法。先将待测样品制成悬液，然后取一先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。算出单位体积内的微生物总数。测定微生物数量的方法：测定微生物数量的方法：背景知识优点：优点：设备简单、能观察微生物的形态设备简单、能观察微生物的形态特征。特征。缺点：缺点：难以计数微小量多的细菌。难以计数微小量多的细菌。一般用于纯培养悬浮液中各种一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。单细胞菌体的计数。2间接计数法：间接计数法：最常用稀释平板计数法。最常用稀释平板计数法。（二）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据：统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在培养后再选择菌落数在30300的平的平板进行计数。板进行计数。每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=(CV)MC：某一稀释度下平板上生长的平均：某一稀释度下平板上生长的平均 菌落数菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积：涂布平板时所用的稀释液的体积 (ml)M：稀释倍数：稀释倍数统计的菌落往往统计的菌落往往比活菌的实际数目低。比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。数而不是活菌数来表示。注意：两位同学用稀释涂布平板法测定同一两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为统计的菌落数为230。2.第二位同学在该深度下涂布了三个平板，第二位同学在该深度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为21、212和和256，该同学，该同学以这三个平板菌落数的平均值以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结作为统计结果。果。实例1你认为哪位同学的结果更接近真实值你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？要，如何改进？第一位同学只涂布了一个平板，没有第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了了3个平板，但是，其中个平板，但是，其中1个平板的计数结个平板的计数结果与另果与另2个相差太远，说明在操作过程中个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。个平板的计数值用来求平均值。?因因此此，这这两两位位同同学学的的实实验验需需要要改改进进，在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致，结结果果不不一一致，意味着操作有误，需要重新实验。致，意味着操作有误，需要重新实验。说明设置重复组的重要性。在做本课题的实验时，在做本课题的实验时，A同学从对应同学从对应106倍倍稀释的培养基中筛选出大约稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择出大约其它同学在同样的稀释度下只选择出大约50个个菌落。菌落。其他同学认为其他同学认为A同学的结果有问题。他们同学的结果有问题。他们分析可能是分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。实例2但是，但是，A同学确信自己的实验操作准同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。因而此时也拿不出令同学们信服的证据。你能通过设置对照，帮助你能通过设置对照，帮助A同学排除同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？上述两个可能影响实验结果的因素吗？一是由于土样不同，二是由于培养基污染一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。证明。一种方案：可以由其他同学用与一种方案：可以由其他同学用与A同学一样同学一样的土样进行实验，如果结果与的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证同学一致，则证明明A无误；如果结果不同，则证明无误；如果结果不同，则证明A同学存在操同学存在操作失误或培养基的配制有问题。作失误或培养基的配制有问题。另一种方案：另一种方案：将将A同学配制的培养基在不加土样的同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。实验设计土壤中分解尿素的细菌的分离与记数土壤中某样品细菌的分离与计数土壤中某样品细菌的分离与计数 从肥沃、湿润的土壤中取样。从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土先铲去表层土3cm左右，再取样，将左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。样品装入事先准备好的信封中。实验步骤实验步骤1土壤取样 制备制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。和移液管。实验步骤2.制备培养基 将将10g土样加入盛有土样加入盛有90mL无菌生理无菌生理盐水的锥形瓶中盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有，转移至盛有9mL水的无菌试管中，水的无菌试管中，依次等比稀释至依次等比稀释至107稀释度，并按照由稀释度，并按照由107至至103稀释度的顺序分别吸取稀释度的顺序分别吸取0.1mL进进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。顺序涂布平板，不必更换移液管。实验步骤3.微生物的培养与观察将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30下下培养。比较牛肉膏培养基和选择培培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。好记录。挑选选择培养基中不同形态的挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否变红。观察能否变红。当菌落数目稳定时，选取菌落数在当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对至少对3个平板进行重复计数，然后求出平个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。样品中细菌的数目。实验步骤4.细菌的计数每克土壤样品菌数每克土壤样品菌数=某稀释倍数的某稀释倍数的菌落平均数菌落平均数稀释倍数稀释倍数细菌培养时细菌培养时所用的稀释液体积所用的稀释液体积一一无菌操作无菌操作1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。灭菌。2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。旁操作。操作提示二二做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。培养样品的稀释度等。三三制订计划制订计划1.某同学在稀释倍数为某同学在稀释倍数为106的培养基中测得的培养基中测得平板上菌落数的平均数为平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4 练一练1.某同学在稀释倍数为某同学在稀释倍数为106的培养基中的培养基中测得平板上菌落数的平均数为测得平板上菌落数的平均数为234，那，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4 练一练2.用稀释涂布平板法来统计样品中活用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比菌的数目，其结果与实际值相比（）A.比实际值高比实际值高B.比实际值低比实际值低C.和实际值一致和实际值一致D.比实际值可能高也可能低比实际值可能高也可能低下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水葡萄糖、尿素、琼脂、水B.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水葡萄糖、琼脂、水C.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水尿素、琼脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水练一练