食品中铜绿假单胞菌检测.pptx

会计学1食品中铜绿假单胞菌检测食品中铜绿假单胞菌检测第一页，编辑于星期二：十一点 七分。一、概一、概 述述n n铜绿假单胞菌（铜绿假单胞菌（P.aeruginosaP.aeruginosa）俗称）俗称绿脓杆菌绿脓杆菌，因为在，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，使伤口与创面呈代谢过程中产生水溶性的绿色色素，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。绿色，故名绿脓杆菌。n n铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖，生铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖，生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合物作长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境广泛存为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如季铵类消在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。毒液，特别是含有一些有机物的液体。第1页/共23页第二页，编辑于星期二：十一点 七分。n n铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过污染医铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感染，因此，疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进行严格消毒灭菌，对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的污染。对铜绿假单胞菌感染的以保证无铜绿假单胞菌的污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大霉素、多粘菌素治疗，可应用庆大霉素、多粘菌素B B和羧苄青霉素。和羧苄青霉素。n n铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强，铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强，56561h1h可可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消毒剂、干燥、杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗紫外线等理化因素及不良环境抵抗 力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强大。大。第2页/共23页第三页，编辑于星期二：十一点 七分。二、生物学特性1.1.培养特性培养特性 本菌属于假单胞菌属，是一种本菌属于假单胞菌属，是一种 非发酵非发酵革兰阴性革兰阴性无芽孢杆菌，菌体无芽孢杆菌，菌体 细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或 短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼运动活泼。2 2菌体形态菌体形态 无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为，菌体笔直或弯曲。运动活泼。菌体的大小为，菌体笔直或弯曲。第3页/共23页第四页，编辑于星期二：十一点 七分。3 3、生化特性、生化特性 n n氧化酶和过氧化氢酶阳性。氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/FO/F试验为氧化型，还试验为氧化型，还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。98 98 菌株产生菌株产生水溶性荧光色素水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能液。铜绿假单胞菌能液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 90 以上以上的菌株产生蓝绿色色素。的菌株产生蓝绿色色素。n n分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分解分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化酶试验阳能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不产硫化氢。性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不产硫化氢。第4页/共23页第五页，编辑于星期二：十一点 七分。三、致病性三、致病性 主要致病物质是主要致病物质是内毒素内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严重的流行性腹泻。重的流行性腹泻。WHO WHO的的HACCPHACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生，患者食入装水很可能导致疾病的发生，患者食入10103 310104 4个菌体细个菌体细胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸盐的含量盐的含量-参考文献参考文献。第5页/共23页第六页，编辑于星期二：十一点 七分。国内外污染情况国内外污染情况-参考文献参考文献 国内污染情况：国内污染情况：-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率；瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率；-瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率。瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率。国外污染情况：国外污染情况：-Richards -Richards等在等在104104件检品中的件检品中的4 4件分离到铜绿假单胞菌；件分离到铜绿假单胞菌；-Rosenberg -Rosenberg报告德国的瓶装矿泉水检出铜报告德国的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。绿假单胞菌。刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报 道道5 5加仑桶装产品（加仑桶装产品（15153131天的保存期），铜绿假单胞天的保存期），铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到菌可生长繁殖达到 CFU/mlCFU/ml。国内卫生标准：国内卫生标准：0 CFU/250ml0 CFU/250ml第6页/共23页第七页，编辑于星期二：十一点 七分。三、实验室检验三、实验室检验三、实验室检验三、实验室检验 GB/T 8538-2008铜绿假单胞菌检测（滤膜法）第7页/共23页第八页，编辑于星期二：十一点 七分。原 理 将将250mL250mL水样用孔径为的滤膜过滤，水样用孔径为的滤膜过滤，并将滤膜移至并将滤膜移至CNCN琼脂培养基上，于琼脂培养基上，于3636士士1 1恒恒温箱中培养温箱中培养48h48h，能够在，能够在CNCN琼脂上生长并产生绿琼脂上生长并产生绿脓菌素，或者能够在脓菌素，或者能够在CNCN琼脂上生长并且氧化酶呈琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（阳性、紫外光（36020nm36020nm）照射下能发荧光、）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。第8页/共23页第九页，编辑于星期二：十一点 七分。培养基和试剂 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避光保存）金氏B 培养基（低温避光保存）乙酰胺肉汤 营养琼脂 氧化酶试剂 钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）第9页/共23页第十页，编辑于星期二：十一点 七分。设备和仪器 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高压蒸汽灭菌15分钟 恒温培养箱：361 紫外灯：波长应为36020nm 滤膜：直径47mm，微孔径为（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3 3次，次，每次每次15 min15 min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2 2次次3 3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜。）无菌滤膜。）显微镜：10100 冰箱：08第10页/共23页第十一页，编辑于星期二：十一点 七分。操作步骤-水样过滤 在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。第11页/共23页第十二页，编辑于星期二：十一点 七分。结果观察 培养20h24h观察滤膜上菌落的生长情况并计数，防止因为培养导致菌落过分生长而出现菌落融合。（40h48h时更容易观察产色素情况和荧光情况）。第12页/共23页第十三页，编辑于星期二：十一点 七分。可疑菌落计数情况 计数所有显计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。判定为铜绿假单胞菌。计数滤膜上所有计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）养基上生长。）将其它所有将其它所有红褐色不发荧光红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、乙的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏酰胺肉汤、金氏B B培养基确证实验。培养基确证实验。第13页/共23页第十四页，编辑于星期二：十一点 七分。纯 化 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基，于361培养 20h24h，对可疑菌进行纯化。第14页/共23页第十五页，编辑于星期二：十一点 七分。将最初显红褐色的菌落进行将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验氧化酶试验 氧化酶试验氧化酶试验 ：原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C C氧化，再由氧化，再由氧化型细胞色素氧化型细胞色素C C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。操作：取操作：取2 23 3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在预备好的滤纸上。在1010秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。第15页/共23页第十六页，编辑于星期二：十一点 七分。产氨实验（乙酰胺肉汤乙酰胺肉汤）原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂（碘化钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。色的络合物。操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在在363611下培养下培养20h20h24h24h。然后向每支试管培。然后向每支试管培养物加入养物加入1 12 2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从况，如表现出从深黄色到砖红色深黄色到砖红色的颜色变化，则为的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。阳性结果，否则为阴性。第16页/共23页第十七页，编辑于星期二：十一点 七分。产荧光素实验（金氏金氏B B培养基）培养基）原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于361恒温箱培养24h5d。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。第17页/共23页第十八页，编辑于星期二：十一点 七分。计数结果说明 菌落计数公式：菌落计数公式：NNP PF(cF/nF)F(cF/nF)R(cR/nR)R(cR/nR)P P是呈蓝是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。的菌落）。F F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。R R是呈红褐色的菌落数。是呈红褐色的菌落数。nF nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。是进行产氨测试的显荧光菌落数。cF cF是产氨阳性的显荧光菌落数。是产氨阳性的显荧光菌落数。nR nR是进行产氨、氧化酶、金氏是进行产氨、氧化酶、金氏B B培养基上显荧光测试的培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。红褐色菌落数。cR cR是产氨、氧化酶、金氏是产氨、氧化酶、金氏B B培养基上显荧光测试均呈阳培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。性的红褐色菌落数。第18页/共23页第十九页，编辑于星期二：十一点 七分。n n举 例 N=17+16(2/N=17+16(2/5 5)+10(3/)+10(3/5 5)17 17：呈蓝：呈蓝/绿色的菌落数；绿色的菌落数；16 16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数；：没有绿脓色素但显荧光的菌落数；2 2：产氨阳性的显荧光菌落数；：产氨阳性的显荧光菌落数；5 5：进行产氨测试的显荧光菌落数；：进行产氨测试的显荧光菌落数；10 10：呈红褐色的菌落数；：呈红褐色的菌落数；3 3：产氨、氧化酶、金氏：产氨、氧化酶、金氏B B培养基上显荧光测试均呈培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数；阳性的红褐色菌落数；5 5：进行产氨、氧化酶、金氏：进行产氨、氧化酶、金氏B B培养基上显荧光测试的培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。红褐色菌落数。第19页/共23页第二十页，编辑于星期二：十一点 七分。n n样品稀释 若样品污染严重，建议对样品进行稀 释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。n n报 告 结果以 CFU/250ml计。第20页/共23页第二十一页，编辑于星期二：十一点 七分。n n其他确证试验方法其他确证试验方法 自动生化鉴定仪器 生化试剂条（以国标法为参照，二者符 合率-参考文献参考文献）第21页/共23页第二十二页，编辑于星期二：十一点 七分。第22页/共23页第二十三页，编辑于星期二：十一点 七分。